陳克芳，李建軍，潘愛珍，侯祥平

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）早期心肌細(xì)胞丟失的主要方式為細(xì)胞凋亡，凋亡通路的激活決定細(xì)胞凋亡的進(jìn)行，而細(xì)胞凋亡通路主要包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）信號(hào)途徑和不依賴于caspase的兩種信號(hào)通路，依賴于caspase的信號(hào)途徑主要為線粒體途徑。我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，山茱萸總苷可以抑制急性缺氧時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡［1］，但具體機(jī)制尚不清楚，而線粒體的能量耗竭及活性氧的釋放是導(dǎo)致急性心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞壞死、凋亡的主要病理改變，因此認(rèn)為山茱萸與線粒體之間必然存在一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)從對(duì)心肌細(xì)胞凋亡線粒體通路中caspase－9的研究來探明山茱萸總苷抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為開發(fā)治療心肌梗死的天然藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 出生1 d～3 d的SD大鼠，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM無糖培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gbico公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；青霉素－鏈霉素溶液，Gibco公司產(chǎn)品；抗α－Sarcomeric actin，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；SABC抗caspase－9試劑盒及DAB顯示試劑盒，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 山茱萸，廣東一方制藥有限公司提供。

1.4 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司提供。

1.5 方法

1.5.1 山茱萸總苷提取物制備 廣東省中醫(yī)研究所按文獻(xiàn)［2］方法提取，提取物濃縮干燥至粉末狀。

1.5.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將出生1 d～3 d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心臟，迅速放入4℃預(yù)冷D－Hank’s液的培養(yǎng)皿中，洗去心臟表面及血管中的血細(xì)胞，剪去心房和大血管。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入10 mL左右的0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次約10 min。收集除第1次以外的細(xì)胞懸液于50 mL離心管中，加入含量為10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，終止消化。1 000 r／min離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，輕輕吹打使其形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液吸入培養(yǎng)皿中，按差速貼壁法于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，去除成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞。之后輕輕收集尚未貼壁的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL～5×105／mL，接種于6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每2 d換一次液，培養(yǎng)3 d～4 d后使用［3］。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組 缺氧模型組：正常培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，換成無糖DMEM液，用無菌液狀石蠟封住液體表面，使細(xì)胞缺氧［4］。對(duì)照組：心肌細(xì)胞不做任何處理，正常條件培養(yǎng)。山茱萸總苷干預(yù)組：細(xì)胞缺氧處理之前24 h在培養(yǎng)液中加入0.49 g／L的山茱萸總苷，缺氧培養(yǎng)的同時(shí)加入0.49 g／L的山茱萸總苷進(jìn)行干預(yù)。各組設(shè)1 h、2 h、3 h、5 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)觀察。

1.5.4 心肌細(xì)胞的鑒定 按照SABC抗a－橫紋肌肌動(dòng)蛋白試劑盒說明方法：將培養(yǎng)3 d的細(xì)胞爬片用4%的多聚甲醛固定30 min，然后用30%H2O21份＋純甲醇50份混合液室溫浸泡30 min后蒸餾水洗1次～2次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對(duì)照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。二甲苯透明，中性樹膠封片［5］。

1.5.5 SABC法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase－9的表達(dá) 培養(yǎng)的細(xì)胞爬片，3 d后棄去培養(yǎng)基，4%的多聚甲醛固定30 min，30%H2O21份＋純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸餾水洗1次～2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對(duì)照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，20℃～37℃20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色：取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混合均勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般5 min～30 min。蒸餾水洗。蘇木素輕度復(fù)染1 min，自來水沖洗。75%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水平取α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞鑒定 心肌細(xì)胞中含有α－Sarcomeric actin，本實(shí)驗(yàn)選用的一抗為小鼠抗大鼠α－橫紋肌肌動(dòng)蛋白，因此染色后心肌細(xì)胞胞漿將被著深棕色，而非心肌細(xì)胞則呈陰性染色。心肌細(xì)胞的純度鑒定采用每張玻片隨機(jī)取10個(gè)視野，分別計(jì)算出心肌細(xì)胞陽(yáng)性率，重復(fù)3次并取平均值為97.260%、96.875%、96.970%，三者取平均值得出心肌細(xì)胞的純度為97.035%。

2.2 SABC法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase－9的表達(dá) 與對(duì)照組相比，缺氧各組caspase－9的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)的比例增加，5 h達(dá)到最高，給予山茱萸總苷干預(yù)之后，治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的caspase－9表達(dá)都有所下降，與缺氧組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 SABC法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase－9的表達(dá)（x±s）

2.3 心肌細(xì)胞各組caspase－9表達(dá)免疫組化染色情況 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組正常心肌細(xì)胞陽(yáng)性著色的細(xì)胞很少；隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性著色比例較對(duì)照組明顯增多；治療組較缺氧組陽(yáng)性著色比例明顯減少。

3 討 論

凋亡通路的激活引起細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡通路主要包括caspase的信號(hào)途徑和不依賴于caspase的兩種途徑。具體通路主要有2種：外源性途徑和內(nèi)源性途徑。①外源性途徑［6］：Fas等配體與死亡受體（death receptors）結(jié)合，F(xiàn)ADD 聚集，死 亡 效應(yīng)域（death effector domain，DED）形成，caspase－8活化，下游的caspase－3被激活，最終引起細(xì)胞的自動(dòng)連鎖反應(yīng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡。②內(nèi)源性途徑：在該途徑中，線粒體通路起著主要的作用，長(zhǎng)期以來，人們一直忽略了線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用。但是近年來越來越多的對(duì)于線粒體在細(xì)胞凋亡中扮演角色的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體中含有許多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的酶或蛋白、基因等，并且在細(xì)胞凋亡中起著重要的作用，如細(xì)胞色素C（Cyt－C）［7］、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，當(dāng)各種細(xì)胞凋亡信號(hào)，如應(yīng)激、炎癥、缺氧等傳至細(xì)胞后，Cyt－C由線粒體進(jìn)入胞漿，并且結(jié)合凋亡蛋白酶活化 因 子 1（apoptotic protease－activating factor－1，Apaf－1），在ATP 或dATP的作用下，通過改變 Apaf－1的分子結(jié)構(gòu)，引起caspase－9的活化，caspase－9活化之后便會(huì)激活最重要的凋亡執(zhí)行者caspase－3酶系列，引起細(xì)胞凋亡的自動(dòng)連鎖反應(yīng)，完成細(xì)胞凋亡［8］。

由此可知caspase－9在線粒體凋亡途徑中起著非常重要的作用，其與ATP、凋亡蛋白激活因子－1結(jié)合形成凋亡體，激活caspase－3而最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。因此抑制caspase－9的表達(dá)則可以阻斷casepase－3的激活，最終達(dá)到阻止細(xì)胞凋亡的目的。以上的實(shí)驗(yàn)證明正常的心肌細(xì)胞caspase－9幾乎沒有表達(dá)，而缺氧、缺血?jiǎng)t可以引起心肌細(xì)胞的凋亡，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，caspase－9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例明顯增多，表明其參與細(xì)胞凋亡的過程。每組給予山茱萸總苷0.49 g／L干預(yù)后，缺氧處理組的caspase－9陽(yáng)性表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明山茱萸總苷可以抑制caspase－9的表達(dá)，通過阻斷心肌細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)通路而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

［1］ 陳克芳，李建軍，潘愛珍，等.山茱萸總苷干預(yù)急性缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（12）：1488－1489.

［2］ 吳紅，梁恒，劉永紅，等.山茱萸總皂苷的提取分離與含量測(cè)定［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（5）：430－431.

［3］ 辛毅，許秀芳，黃益民.乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及熒光鑒定［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28（5）：541－547.

［4］ 曾文靜，劉菊英，柯昌斌.液體石蠟封閉法建立大鼠心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型［J］.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29（2）：108－110.

［5］ 張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，35（6）：558－561.

［6］ 張玉清，王宇彬，宋書凱.Fas系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志，2008，35（4）：205－207.

［7］ 楊澤棟，李永東.細(xì)胞色素C評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（3）：341－343.

［8］ Youle RJ，Strasser A.The Bcl－2 protein family：Opposing activities that mediate cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（1）：47－59.