李鵬飛，徐開達(dá)，周宏霞

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；2.威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東威海 264210）

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，屬甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，廣泛分布于中國(guó)的四大海域。三疣梭子蟹味道鮮美，食用價(jià)值極高，在中國(guó)屬于重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類之一，因此而成為重要的海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象。自上世紀(jì)50年代，學(xué)者們就開始對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行研究，從最初的生殖、生理生態(tài)、數(shù)量分布、病理等基礎(chǔ)研究開始，至近十幾年前，越來越多的學(xué)者在遺傳學(xué)方面對(duì)不同群體的三疣梭子蟹進(jìn)行了不同程度的研究報(bào)道[1-5]。近幾年來，我國(guó)沿海各地開展了大規(guī)模的三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖，而且養(yǎng)殖技術(shù)非常成熟，在浙江，三疣梭子蟹的人工養(yǎng)殖更是廣泛。三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展加快了中國(guó)沿海三疣梭子蟹苗種的南北交流，造成其種質(zhì)資源的混雜，必然產(chǎn)生了其種質(zhì)資源管理和保護(hù)等方面的問題。另外，三疣梭子蟹放流技術(shù)也很成熟，在浙江，每年都有大規(guī)模的三疣梭子蟹人工增殖放流，尤其近幾年，在“東海無魚”的影響下，在加大各種海洋經(jīng)濟(jì)物種增殖放流規(guī)模的政策影響下，浙江沿海三疣梭子蟹的放流力度更是加強(qiáng)，以至于2014年出現(xiàn)了三疣梭子蟹賣出白菜價(jià)格的現(xiàn)象。如此大規(guī)模的增殖放流必然會(huì)對(duì)自然海域三疣梭子蟹野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此，我們應(yīng)該加大對(duì)野生三疣梭子蟹資源的保護(hù)力度，監(jiān)測(cè)和保護(hù)其種質(zhì)資源，建立三疣梭子蟹的保護(hù)區(qū)和原種場(chǎng)，以降低三疣梭子蟹野生資源的遺傳衰退速度，防止野生群體的種質(zhì)退化和優(yōu)良性狀的喪失，同時(shí)，要加強(qiáng)蟹苗規(guī)范化管理，有計(jì)劃地開發(fā)利用浙江近海三疣梭子蟹資源，保持其進(jìn)化潛力和可持續(xù)利用，真正實(shí)現(xiàn)對(duì)三疣梭子蟹資源的合理開發(fā)利用[6]。

微衛(wèi)星標(biāo)記因其多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于種質(zhì)鑒定及遺傳育種等研究。用微衛(wèi)星標(biāo)記研究三疣梭子蟹的報(bào)道也比較多[7-9]，但是用微衛(wèi)星標(biāo)記研究比較浙江近海三疣梭子蟹種質(zhì)極遺傳方面內(nèi)容的報(bào)道未見。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記用毛細(xì)血管電泳法對(duì)浙江近海三疣梭子蟹野生群體及苗種場(chǎng)的親蟹、仔蟹進(jìn)行遺傳分析，以期為浙江近海三疣梭子蟹野生群體種質(zhì)資源的保護(hù)和遺傳育種研究提供理論的科學(xué)依據(jù)，也為三疣梭子蟹苗種場(chǎng)的人工選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的三疣梭子蟹4個(gè)群體中，2個(gè)群體是西軒試驗(yàn)場(chǎng)的親蟹（A群體，捕自浙江近海180海域，野生群體）及其子一代的幼蟹（B群體，養(yǎng)殖群體），另外2個(gè)群體分別是同年從162-169海域（C群體，野生群體）、177-178海域（D群體，野生群體）捕獲的三疣梭子蟹樣品中隨機(jī)取得，三個(gè)野生群體均為長(zhǎng)江口附近海域。三疣梭子蟹樣品取得后，取其大螯肌肉于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

三疣梭子蟹DNA提取方法是參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[10]中DNA的提取方法，提取基因組DNA后放于超低溫冰箱中保存。

1.2.2 微衛(wèi)星分析

對(duì)大量的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，最終選擇了6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)[7，8]用于實(shí)驗(yàn)，用毛細(xì)血管電泳法對(duì)4個(gè)群體的三疣梭子蟹進(jìn)行了STR微衛(wèi)星檢測(cè)。所用微衛(wèi)星位點(diǎn)的基本特征見表1。

表1 三疣梭子蟹6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基本特征Tab.1 Characterization of 6 microsatellite markers for P.trituberculatus

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通過用毛細(xì)血管電泳法對(duì)4個(gè)群體的三疣梭子蟹進(jìn)行了STR微衛(wèi)星檢測(cè)，獲得了微衛(wèi)星檢測(cè)數(shù)據(jù)，每對(duì)引物中A、B、C、D四個(gè)群體其中一個(gè)個(gè)體在的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

圖1 6個(gè)位點(diǎn)分別在4個(gè)三疣梭子蟹群體中（依次為：A、B、C、D）的一個(gè)個(gè)體中擴(kuò)增得到的電泳圖譜Fig.1 Six loci amplified in 1 individual in 4 populations of Portunus trituberculatus(in turn A、B、C、D)

用CERVUS和Genepop V4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得了等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、觀測(cè)雜合度、期望雜合度。

結(jié)果顯示，所選的的6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為多態(tài)位點(diǎn)，6個(gè)位點(diǎn)在4個(gè)三疣梭子蟹群體中96個(gè)個(gè)體中共擴(kuò)增得到227個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)含有26～48個(gè)等位基因不等，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?8個(gè)，PRT6b的等位基因數(shù)最多。

多態(tài)信息含量是衡量遺傳標(biāo)記位點(diǎn)變異程度高低的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。多態(tài)信息含量可以反映出某個(gè)標(biāo)記所包含或所提供的遺傳信息內(nèi)容，根據(jù)多態(tài)信息含量的計(jì)算方法[11]，當(dāng)多態(tài)信息含量>0.5時(shí)，位點(diǎn)為高度多態(tài)信息位點(diǎn)，當(dāng)0.25<多態(tài)信息含量<0.5時(shí)，為中度多態(tài)性位點(diǎn)，當(dāng)多態(tài)信息含量<0.25時(shí)，為較低多態(tài)位點(diǎn)，基本上不用來研究分析遺傳多樣性。經(jīng)分析，本研究所選6個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量在范圍為0.919 7～0.966 0，說明6個(gè)位點(diǎn)能夠很好的反映4個(gè)群體內(nèi)和群體間的遺傳關(guān)系。

雜合度作為反映多態(tài)性高低的一個(gè)重要參數(shù)，雜合度的大小可以反映群體等位基因的豐富程度及群體遺傳變異的高低。一般情況下，雜合度的數(shù)值越大說明群體的變異型越大，遺傳多樣性也就越豐富。經(jīng)分析，4個(gè)群體的平均觀測(cè)雜合度在0.478 7和0.915 8之間，平均期望雜合度在0.924 5和0.966 0之間。該結(jié)果表明4個(gè)群體均出現(xiàn)較高的遺傳多樣性。本研究結(jié)果顯示4個(gè)群體的三疣梭子蟹都處于較高的遺傳多樣性水平。通過對(duì)4個(gè)群體6個(gè)位點(diǎn)的卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了PTR33a表現(xiàn)為極度顯著偏離Hardy-Weinberg平衡外，其余位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡。經(jīng)群體間的遺傳分化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6個(gè)位點(diǎn)的Fst值在0.014 2-0.049 8之間，均小于0.05，說明4個(gè)群體間未產(chǎn)生遺傳分化。

根據(jù)微衛(wèi)星數(shù)據(jù)計(jì)算了4個(gè)群體的遺傳距離和相似度（對(duì)角線上），如表2，并根據(jù)遺傳距離構(gòu)建了4個(gè)群體的UPGMA聚類樹，如圖2。結(jié)果顯示親蟹A群體和其子一代B群體的遺傳距離相對(duì)較大，與其他2個(gè)野生群體的遺傳距離相對(duì)較小。反映在系統(tǒng)樹上，也得到了相同的結(jié)果。

圖2 三疣梭子蟹4個(gè)群體的UPGMA系統(tǒng)樹Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree based on the D-loop of 4 populations

表2 三疣梭子蟹4個(gè)群體間和群體內(nèi)的遺傳距離和相似性指數(shù)Tab.2 Genetic distance and identity of P.trituberculatus from 4 populations

3 討論

眾所周知遺傳多樣性的研究是遺傳育種過程中必須的研究?jī)?nèi)容，對(duì)于種質(zhì)資源的管理和保護(hù)也具有重要的意義。在遺傳學(xué)育種工作中，微衛(wèi)星標(biāo)記也是非常有效的一種分子標(biāo)記技術(shù)。本研究用微衛(wèi)星的方法對(duì)浙江長(zhǎng)江口和附近海域的三疣梭子蟹及苗種場(chǎng)三疣梭子蟹親蟹和其子一代共4個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多樣性研究，獲得了三疣梭子蟹種質(zhì)資源遺傳變異的基本數(shù)據(jù)，并取得了較好的分析結(jié)果，結(jié)果表明了研究的4個(gè)群體的三疣梭子蟹都具有較高的遺傳變異，與筆者用控制區(qū)序列分析的方法[6]對(duì)該4個(gè)群體的遺傳多樣性研究的結(jié)果相似。近年來，隨著浙江對(duì)三疣梭子蟹放流力度的加大，勢(shì)必會(huì)造成自然海域中三疣梭子蟹種質(zhì)資源的混雜，而每年的親本大多又取自自然海域，從本研究的結(jié)果看，雖然繁育的子一代三疣梭子蟹也具有較高的遺傳多樣性，但是相對(duì)于野生群體來說遺傳多樣性稍有下降。本研究結(jié)果為三疣梭子蟹育苗場(chǎng)加強(qiáng)遺傳育種，實(shí)現(xiàn)對(duì)三疣梭子蟹的合力開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為三疣梭子蟹的種質(zhì)資源保護(hù)、原種場(chǎng)的建立及人工放流方案的制定等提供科學(xué)依據(jù)。

[1]戴愛云,楊思諒,宋玉枝,等.中國(guó)海洋蟹類[M].北京:海洋出版社,1986:194-196.

[2]宋海棠,丁躍平,許源劍.浙江北部近海三疣梭子蟹繁殖習(xí)性研究[J].浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),1988,7(1):39-46.

[3]俞存根,宋海棠,姚光展.東海蟹類的區(qū)系特征和經(jīng)濟(jì)蟹類資源分布[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,22(2):108-113.

[4]馮冰冰,李家樂,牛車紅,等.我國(guó)四大海域三疣梭子蟹線粒體控制區(qū)基因片段序列比較分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,17(2):134-139.

[5]相 瑜,任麗萍,王日昕.三疣梭子蟹微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及特征分析[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,32(5):421-425.

[6]李鵬飛,朱文斌,賀舟挺,等.浙江近海三疣梭子蟹4個(gè)群體的控制區(qū)序列分析[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,32(6):484-487.

[7]李曉萍,劉 萍,宋協(xié)法.三疣梭子蟹微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建與群體遺傳分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2011,18(1):194-201.

[8]劉 磊,李 健,劉 萍,等.三疣梭子蟹微衛(wèi)星標(biāo)記與生長(zhǎng)相關(guān)性狀的相關(guān)性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(7):1 034-1 041.

[9]吳惠仙,徐雪娜,薛俊增,等.中國(guó)沿海三疣梭子蟹的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析[J].海洋學(xué)研究,2009,27(3):48-53.

[10]薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆試驗(yàn)指南[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[11]BOSTEIN D,WHITE R L,SKOLNICK M.Construction of agenetic linkage map in man using restriction fragment length polynorphisms[J].Am J Hum,1980,32:314-331.