秦 瑤，趙鴻彥，張文航，王冬梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

使用FVB/N和C57BL/6品系小鼠制備TFAM敲低轉(zhuǎn)基因小鼠的比較

秦 瑤，趙鴻彥，張文航，王冬梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目的 比較TFAM敲低對(duì)不同品系小鼠的影響。方法 通過(guò)慢病毒顯微注射的方法分別制備FVB/N和C57BL/6品系的TFAM敲低轉(zhuǎn)基因小鼠；統(tǒng)計(jì)比較兩種品系小鼠的制備和繁殖情況；使用定量PCR方法檢測(cè)比較兩種品系小鼠中TFAM的敲低情況。結(jié)果 使用PCR方法可鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，此小鼠耳朵皮膚組織可觀察到綠色熒光；兩種品系轉(zhuǎn)基因小鼠具有相似的TFAM敲低水平；TFAM敲低能夠子代遺傳；C57BL/6敲低小鼠的繁殖能力顯著弱于FVB/N小鼠。結(jié)論 成功制備了FVB/N和C57BL/6品系的TFAM敲低轉(zhuǎn)基因小鼠，TFAM敲低對(duì)于兩種品系的小鼠具有明顯不同的影響。

線粒體；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A；轉(zhuǎn)基因小鼠

線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的能量代謝細(xì)胞器，對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能具有重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)大量的疾病都與線粒體功能的紊亂有關(guān)[1-3]。心臟是一個(gè)高能量代謝的器官，線粒體功能的缺陷，對(duì)心臟的影響尤其嚴(yán)重，心衰，心律失常，心力衰竭等臨床表現(xiàn)均與線粒體異常有關(guān)[4-5]。深入了解線粒體功能對(duì)線粒體相關(guān)疾病的研究具有重要的意義。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是一個(gè)重要的線粒體相關(guān)蛋白，對(duì)于維持線粒體正常功能有著重要作用。通過(guò)組織特異性敲除TFAM能夠得到線粒體DNA(mtDNA)異常，以及線粒體功能缺陷的小鼠[6]。通過(guò)RNA干擾技術(shù)能夠獲得多組織TFAM下調(diào)的轉(zhuǎn)基因小鼠，這種小鼠的心臟細(xì)胞線粒體功能受損[7]。這些基因敲除及敲低的小鼠為在整體水平上研究線粒體相關(guān)疾病提供了很好的模型。

由于不同的疾病有著不同的最適合的小鼠品系模型，因此本研究中我們使用兩種不同的小鼠品系制備了TFAM敲低的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)同樣的條件下，TFAM的敲低對(duì)于不同品系的小鼠的生存繁殖會(huì)產(chǎn)生顯著不同的影響，本研究為在不同品系小鼠中研究基因功能提供了重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 293FT細(xì)胞購(gòu)于life technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 FVB/N和C57BL/6小鼠購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293FT細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，青鏈霉素，置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 TFAM敲低慢病毒制備 TFAM敲低病毒載體pLentis-Ubi-GFP-miRTFAM以及病毒制備方法見(jiàn)前文獻(xiàn)描述[7]。TFAM的干擾序列通過(guò)XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)連接到載體pLentis-Ubi-GFP-miR30中，獲得TFAM干擾病毒載體pLentis-Ubi-GFP-miRTFAM。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將包裝質(zhì)粒和病毒載體同時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集上清病毒液，50 000g超速離心后用適量HBSS重懸，得到濃縮病毒液用于胚胎轉(zhuǎn)染。

1.3.3 TFAM敲低轉(zhuǎn)基因小鼠制備 通過(guò)將TFAM敲低病毒注射到小鼠胚胎透明帶下的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)描述[8]。將濃縮的病毒液注射到收集的小鼠胚胎透明帶下，然后將注射后活性狀態(tài)正常的胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管膨大部，待小鼠出生后，鑒定制備成功的轉(zhuǎn)基因小鼠，用于后繼繁殖。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定 剪取小鼠尾端約0.5cm組織，使用Takara公司DNAiso reagent提取基因組，以此基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定PCR條帶。所用引物為:WPRE F:TGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCC; WPRE R:AGGGAGATCCGACTCGTCTGA。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因小鼠熒光鑒定 在小鼠耳朵外側(cè)剪

取一小塊組織，用鑷子小心從中間分為腹側(cè)和背側(cè)，將分開(kāi)的樣本置于載玻片上，用正置熒光顯微鏡觀察樣本熒光。

1.3.6 TFAM定量PCR檢測(cè) 剪取一小塊小鼠耳朵組織，使用Takara公司RNAiso提取總RNA，Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用此cDNA為模板，Takara公司SYBR?Premix DimerEraserTM試劑進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。所用儀器為Agilent Stratagene MX3000P定量PCR儀。所用引物為TFAM qF:CAAAGGATGATTCGGCTCAG; TFAM qR:AAGCTGAATATATGCCTGCTTTTC; Act qF:CTAAGGCCAACCGTGAAAAG ;Act qR:ACCAGAGGCATACAGGGACA。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析和作圖。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義。

2 結(jié)果

2.1 FVB/N和C57BL/6小鼠制備TFAM敲低轉(zhuǎn)基因小鼠統(tǒng)計(jì) 使用顯微注射的方法制備FVB/N和C57BL/6品系的TFAM敲低小鼠，獲得的首建鼠(F0)可以使用PCR的方法檢測(cè)病毒成功整合的陽(yáng)性小鼠(見(jiàn)圖1)；通過(guò)剪取耳朵組織進(jìn)行熒光顯微鏡觀察能夠鑒定轉(zhuǎn)基因成功表達(dá)的陽(yáng)性小鼠(見(jiàn)圖2)。FVB/N小鼠出生率為6.2%(16/260)，C57BL/6小鼠出生率為8.3%(26/313)，而出生小鼠的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率FVB/N(56.3%)遠(yuǎn)高于C57BL/6(11.5%)(見(jiàn)表1)。提示FVB/N小鼠對(duì)TFAM敲低有更好的耐受。

WT：野生型小鼠；C57 1，C57 2，C57 3：3只C57BL/6陽(yáng)性小鼠；FVB 1，F(xiàn)VB 2，F(xiàn)VB 3，F(xiàn)VB 4：4只FVB/N陽(yáng)性小鼠；Marker: Takara DL2000 DNA ladder。

A：野生型小鼠；B： C57BL/6陽(yáng)性小鼠1；C：C57BL/6陽(yáng)性小鼠2；D：FVB/N陽(yáng)性小鼠1；E：FVB/N陽(yáng)性小鼠2。

表1 胚胎操作和小鼠制備情況

FVB/NC57BL/6胚胎小鼠胚胎小鼠采集注射移植出生轉(zhuǎn)基因采集注射移植出生轉(zhuǎn)基因352288260169386354313263

采集：采集的胚胎數(shù)；注射：注射病毒的胚胎數(shù)；移植：移植到假孕母鼠的胚胎數(shù)；出生：假孕母鼠生產(chǎn)的小鼠數(shù)；轉(zhuǎn)基因：鑒定的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠數(shù)。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖情況統(tǒng)計(jì) 鑒定的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠雜交進(jìn)行繁殖。F1代小鼠存活率(FVB/N 84.4% vs C57BL/6 39.4%)和存活小鼠陽(yáng)性率(FVB/N 85.2% vs C57BL/6 30.8%)，F(xiàn)2代小鼠存活率(FVB/N 85.7% vs C57BL/643.2%)和存活小鼠陽(yáng)性率(FVB/N 73.3% vs C57BL/6 43.8%)，F(xiàn)VB/N小鼠均顯著高于C57BL/6小鼠(見(jiàn)表2)。提示TFAM敲低對(duì)小鼠繁殖有持續(xù)性影響。

表2 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖情況

FVB/NC57BL/6F1F2F1F2出生存活陽(yáng)性出生存活陽(yáng)性出生存活陽(yáng)性出生存活陽(yáng)性3227233530223313437167

出生：生產(chǎn)出的小鼠數(shù)；存活：3周后仍存活的小鼠數(shù)；陽(yáng)性：鑒定為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的小鼠數(shù)。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠中TFAM表達(dá)水平分析

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠TFAM表達(dá)分析 使用定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠TFAM基因轉(zhuǎn)錄情況。兩種品系小鼠中TFAM均被有效的敲低，此表型在子代小鼠中能夠得到穩(wěn)定遺傳。FVB/N和C57BL/6小鼠中TFAM的敲低水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

3 討論

通過(guò)敲除或敲低TFAM基因獲得的線粒體缺陷的小鼠，是研究線粒體相關(guān)疾病的一種重要模式動(dòng)物。TFAM完全敲除對(duì)小鼠有致死性，其胚胎無(wú)法正常發(fā)育完全，從而限制了這一模型的使用[9]。前期我們用RNA干擾方法制備了TFAM敲低的小鼠，這種小鼠中線粒體功能同樣受到損傷，并且TFAM敲低的胚胎能夠正常發(fā)育。但是相比于野生型小鼠，TFAM敲低的C57BL/6小鼠繁殖能力明顯低下。在本研究中我們同時(shí)制備了TFAM敲低的FVB/N小鼠，發(fā)現(xiàn)TFAM的敲低對(duì)FVB/N小鼠的繁殖能力并未產(chǎn)生明顯的影響。比較兩種小鼠的TFAM基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)其TFAM敲低水平一致，說(shuō)明這種變化并非是由TFAM的敲低所引起的，更可能是由于不同品系小鼠之間的基因差別導(dǎo)致的。對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，不同的人種或不同的人群對(duì)于某些疾病的易感性有顯著的差別，這種差別有可能是核苷酸多態(tài)性或者表觀遺傳學(xué)多樣性所導(dǎo)致的。在小鼠中這一情況也同樣存在，例如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)在不同品系小鼠中誘導(dǎo)反應(yīng)并不一致，通常使用C57BL/6小鼠能夠較好的誘導(dǎo)[10]；3-型鼠肝炎病毒(MHV-3)感染對(duì)C57BL/6具有致死性，而A/J小鼠卻能抵抗這種病毒感染[11]。我們的實(shí)驗(yàn)也提示了FVB/N小鼠對(duì)于TFAM的缺陷的耐受性顯著強(qiáng)于C57BL/6小鼠，可能是這種小鼠存在一定的線粒體缺陷的補(bǔ)償機(jī)制。總的來(lái)說(shuō)，盡管同一物種不同種群之間基因組序列僅有微小的差別，其對(duì)于外在因素的反應(yīng)卻有巨大差異。因此對(duì)于疾病的動(dòng)物水平研究，充分考慮這一因素對(duì)于后繼的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究將有重要的意義。

對(duì)于線粒體相關(guān)疾病的研究來(lái)說(shuō)，其基因多態(tài)性對(duì)于疾病的進(jìn)程會(huì)產(chǎn)生一定的影響[12]。我們的實(shí)驗(yàn)同樣反映出了不同品系小鼠基因差別導(dǎo)致的對(duì)線粒體缺陷的不同反應(yīng)。由于線粒體缺陷可能導(dǎo)致各種不同組織的疾病，而不同疾病在不同品系小鼠上具有不同的易感性，因此研究線粒體相關(guān)疾病可能會(huì)用到各種不同的小鼠品系上的疾病模型。在這種情況下，考慮到線粒體缺陷對(duì)小鼠繁殖能力的影響，如果用C57BL/6則可能因?yàn)榉敝沉μ醵鵁o(wú)法順利的進(jìn)行研究。因此可以選擇既能誘導(dǎo)此疾病，又能在線粒體缺陷下正常繁殖的品系來(lái)制備轉(zhuǎn)基因小鼠，從而獲得足夠的種群來(lái)進(jìn)行相關(guān)的研究。因此本研究對(duì)于線粒體缺陷疾病模型的建立同樣具有引導(dǎo)性的意義。

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[收稿2014-09-23;修回2014-11-07]

(編輯：譚秀榮)

Comparison of preparing TFAM knockdown transgenic mice using FVB/N and C57BL/6 mouse strains

QinYao,ZhaoHongyan,ZhangWenhang,WangDongmei

(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University ,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective Compare the influence of transcription factor A, mitochondrial (TFAM) knockdown (down-regulating gene expression by RNA interference) in different mouse lines.Methods TFAM knockdown mice of the FVB/N and C57BL/6 strain were prepared by lentivirus microinjection; The production and reproduction of these transgenic mice were compared; The knockdown levels of TFAM in the transgenic mice were measured by qPCR.Results Green fluorescence can be observed in skin tissues of ears from transgenic mice identified by PCR. There were comparable TFAM knockdown levels between these two strains. TFAM knockdown was germinal transmissible. The reproductive potential of the C57BL/6 strain was much weaker than the FVB/N strain.Conclusion TFAM knockdown mice were successfully produced in both FVB/N and C57BL/6 stains. TFAM knockdown has various effects on these two mouse strains.

mitochondria; mitochondrial transcription factor A; transgenic mice

貴州省省長(zhǎng)基金臨床應(yīng)用課題專項(xiàng)(NO:黔省專合字[2012]180)。

R54

A

1000-2715(2015)01-0045-04