高夕英， 張英豪， 張榮杰

論 著

鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

高夕英， 張英豪， 張榮杰

目的 研究鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)，分析其與食管鱗癌臨床病理特征間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)AnnexinⅡ在41例食管鱗癌組織及配對(duì)的癌旁組織、10例正常胃組織中的表達(dá)。 結(jié)果 AnnexinⅡ蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織及正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。食管鱗癌組織中Annexin Ⅱ的表達(dá)水平與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、浸潤(rùn)深度、臨床分期無(wú)關(guān)(均P>0.05)。結(jié)論AnnexinⅡ的表達(dá)在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，有望作為食管鱗癌診治的新靶點(diǎn)。

鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ； 食管鱗癌； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移； 腫瘤分化

食管癌在我國(guó)是較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率逐年提高[1]。以手術(shù)為主的綜合治療雖改善了食管鱗癌患者的生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期生存，但往往治療后仍會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，總5年生存率不到30%[2]。鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)是Annexins超家族中A亞家族的重要成員，具有鈣離子介導(dǎo)的磷脂結(jié)合特性，其在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富，在人體細(xì)胞中的作用主要是參與細(xì)胞膜的形成、細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)、吞吐、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化以及凋亡等重要的生命過(guò)程[3]。近年來(lái)的報(bào)道AnnexinⅡ的表達(dá)失調(diào)與諸多腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等機(jī)制的形成中扮演重要角色[4]。但關(guān)于AnnexinⅡ在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義的報(bào)道較少，本研究擬通過(guò)測(cè)定AnnexinⅡ在食管鱗癌中的表達(dá)探討其能否成為食管鱗癌診斷治療指標(biāo)的可能性。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集榮成市人民醫(yī)院2009年4月至2011年7月手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)41例食管鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本，在41例標(biāo)本中，均含有配對(duì)的癌旁組織(距癌組織≥5 cm)。所有標(biāo)本均有完整臨床資料、病理分化程度和隨訪資料，且術(shù)前均未行放化療等治療。其中男23例，女18例，男女之比1.28∶1，年齡42～81歲，中位年齡56.5歲；中低分化14例，高分化27例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。腫瘤浸潤(rùn)深度：淺肌層17例，深肌層15例，纖維膜9例。TNM分期Ⅰ期11例，Ⅱ期12例，Ⅲ期16例，Ⅳ期2例。同時(shí)另選取10例食管良性病例的正常食管組織切片作為正常對(duì)照，所有標(biāo)本均置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 AnnexinⅡ抗體 鼠抗人單克隆抗體(濃度為1∶300)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，EliVisionTM試劑盒、免疫組化二抗均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化方法及陽(yáng)性判定 按照試劑盒說(shuō)明步驟操作，在自動(dòng)免疫組化染色儀將樣本固定、包埋、切片，染色固化。在顯微鏡下觀察照相，以圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以細(xì)胞膜、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為AnnexinⅡ陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性判定在雙盲法下進(jìn)行，依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]的方法，即：每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為，無(wú)色(-)為0分、淺黃色(+)為1分、黃色及更深顏色(++)為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～50%為1分，>50%為2分。兩項(xiàng)得分相乘，結(jié)果≥2分為陽(yáng)性病例，<2分為陰性病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同食管組織中AnnexinⅡ的表達(dá)的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，AnnexinⅡ與食管鱗癌臨床病理特征間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中AnnexinⅡ蛋白的表達(dá) AnnexinⅡ陽(yáng)性表達(dá)為在細(xì)胞膜、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(見(jiàn)圖1～3)，本研究結(jié)果顯示，AnnexinⅡ蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于配對(duì)的癌旁組織及正常的食管組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 不同胃組織中AnnexinⅡ的表達(dá)

組織類型例數(shù)(n)AnnexinⅡ表達(dá)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2值P值食管鱗癌組織41301173.178.534*0.000癌旁組織41142734.157.612#0.000正常組織100100

*:AnnexinⅡ在食管鱗癌組織與癌旁組織中表達(dá)的比較；#：AnnexinⅡ癌旁組織與正常組織中表達(dá)的比較。

2.2 AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征間的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中Annexin Ⅱ的表達(dá)水平與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、浸潤(rùn)深度、臨床分期無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征間的相關(guān)性

3 討論

人AnnexinⅡ蛋白最早作為一種酪氨酸蛋白激酶的作用底物被發(fā)現(xiàn)，具有結(jié)合磷脂、結(jié)合蛋白等諸多生理作用。 AnnexinⅡ蛋白的分子量為36 kD，其基因位于15q21-q22，含1.4 kb編碼基因，有3個(gè)假基因分別位于4號(hào)、9號(hào)、10號(hào)染色體上，并由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成[6]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究表明，AnnexinⅡ的表達(dá)與諸多腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移有著緊密聯(lián)系。Nedjadi 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ蛋白可與S100A6形成聚合體，共同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力，由此推斷AnnexinⅡ蛋白與胰腺癌的發(fā)展直接相關(guān)。Ohno 等[8]發(fā)現(xiàn)AnnexinⅡ蛋白通過(guò)參與細(xì)胞增殖及改變膜生理學(xué)特性來(lái)增加腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移幾率，并預(yù)測(cè)AnnexinⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌是否轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)因子。國(guó)內(nèi)蘇紅英等[9]觀察AnnexinⅡ在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Annexin Ⅱ mRNA的表達(dá)量高于癌旁肝組織和正常肝組織，是癌旁肝組織的3.38倍，是正常肝組織的4.42倍，由此推測(cè)AnnexinⅡ可能成為肝細(xì)胞癌臨床診斷的新指標(biāo)。黨秋紅等[10]探討了乳腺癌浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)及其意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AnnexinⅡ蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)率為90.00%(54/60)，明顯高于在乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)率，且AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。盡管如此，目前關(guān)于AnnexinⅡ蛋白與食管鱗癌的相關(guān)研究較少，因此在本研究中，我們探討食管鱗癌與其配對(duì)癌旁組織及正常組織中AnnexinⅡ的表達(dá)及其意義。通過(guò)免疫組化結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中的AnnexinⅡ的表達(dá)陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁胃組織及正常胃組織，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，食管鱗癌組織中Annexin Ⅱ的表達(dá)水平與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，這說(shuō)明AnnexinⅡ的高表達(dá)與食管鱗癌的惡性程度有密切的相關(guān)性。

目前有關(guān)AnnexinⅡ促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究開(kāi)展尚不全面，現(xiàn)已知AnnexinⅡ在細(xì)胞中可以單體、異源二聚體和異源四聚體存在，多分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜。Mai等[11]研究中指出， AnnexinⅡ的異源四聚體主要在惡性腫瘤細(xì)胞表面分布，可作為多種蛋白酶及細(xì)胞外基質(zhì)成份的結(jié)合位點(diǎn)或協(xié)同作用靶點(diǎn)，通過(guò)以下可能的途徑產(chǎn)生作用：(1)具有減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分粘附的作用，通過(guò)與抗粘附分子(如鍵生蛋白-C)反應(yīng)釋放更多蛋白酶，從而達(dá)到水解細(xì)胞外基質(zhì)的目的；通過(guò)與t-PA、PLG、組織蛋白酶B等蛋白質(zhì)協(xié)同反應(yīng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)新生血管的生成；(2)通過(guò)與某些因子例如血管形成因子(如VEGF) 與S-100A4相互作用，從而促進(jìn)腫瘤新生血管形成，對(duì)腫瘤細(xì)胞侵犯周圍組織的過(guò)程有協(xié)助；(3)通過(guò)和細(xì)胞骨架成分結(jié)合分子(如肌成束蛋白)、黏附分子(如ALCAM)的相互協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)正常組織的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。從以上幾個(gè)可能途徑推測(cè)，食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，AnnexinⅡ可能通過(guò)促使上述這些蛋白酶以及其底物和相關(guān)分子相互作用，導(dǎo)致蛋白酶的前體活化、新生血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤處的脫離、轉(zhuǎn)移、侵襲周圍的正常組織的能力起到幫助作用，具體的機(jī)制研究將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

綜上所述，AnnexinⅡ有可能在食管鱗癌的生長(zhǎng)、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起到了重要的作用，其有可能應(yīng)用于臨床作為評(píng)估食管鱗癌的惡性程度和預(yù)后的指標(biāo)，并有望作為食管鱗癌早期的診斷依據(jù)及基因治療的新靶點(diǎn)。

[1] 魏玲,李蘇宜,曹蘇生. Bmi-1在食管鱗癌組織中表達(dá)及意義[J].中國(guó)腫瘤外科雜志, 2010, 2(5): 279-281.

[2] Nakajima M, Kato H. Treatment options for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Expert Opin Pharmacother, 2013, 14(10):1345-1354.

[3] Drücker P, Pejic M, Galla HJ, et al. Lipid segregation and membrane budding induced by the peripheral membrane binding protein annexin A2[J]. J Biol Chem, 2013, 288(34):24764-24776.

[4] Sharma MC, Sharma M. The role of annexin Ⅱ in angiogenesis and tumor progression: a potential therapeutic target[J]. Curr Pharm Des, 2007, 13(35):3568-3575.

[5] 王波,張華,盧康平.膜聯(lián)蛋白Ⅰ在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2012, 9(14):77-79.

[6] Bharadwaj A, Bydoun M, Holloway R,et al Annexin A2 heterotetramer: structure and function[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(3):6259-6305.

[7] Nedjadi T, Kitteringham N, Campbell F, et al. S100A6 binds to annexin Ⅱ in pancreatic cancer cells and promotes pancreatic cancer cell motility[J]. Br J Cancer, 2009, 101(7):1145-1154.

[8] Ohno Y, Izumi M, Kawamura T, et al. Annexin Ⅱ represents metastatic potential in clear-cell renal cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 2009, 101(2):287-294.

[9] 蘇紅英, 黃雄飛, 馬創(chuàng), 等. 鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ在人肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2012, 29(10):1896-1898.

[10] 黨秋紅, 葉明, 曾憲旭, 等. MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 腫瘤預(yù)防與治療, 2011, 24(4):146-149.

[11] Mai J,Waisman DM, Sloane BF, et al. Cell surface complex of cathepsin B/annexin II tetramer in malignant progression[J]. Biochim Biophys Acta,2000,1477(1-2): 215-230.

The expression and clinical significance of AnnexinⅡ in esophageal squamous cell cancer

GAOXiying,ZHANGYinghao,ZHANGRongjie

(DeparomentofEndoerinology,RongchengPeople’sHospital,AffiliatedHospitalofTaishanMedicalCollege,Rongcheng264300,China)

GAOXiying,E-mail：qbtzsss@163.com

Objective To expcore the expression and clinical significance of Annexin Ⅱ in esophageal squamous cell cancer and analyze the relationship between Annexin Ⅱ and clinicopathological features. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of AnnexinⅡ among 41 matched pairs of esophageal squamous cell cancer tissues and 10 cases of normal esophageal tissues. Results There were obviously differences in the expression of Annexin Ⅱ in esophageal squamous cell cancer tissues, circa-cancerous tissues and normal esophageal tissues(P<0.05). In the specimens of esophageal squamous cell cancer, expression of Annexin Ⅱ related to cell differentiation of tumors and metastasis of lymph node, no relation to age, sex, depth of invasion and clinical stage(P>0.05). Conclusions The expressions of Annexin Ⅱ had important effect in development and growth in esophageal squamous cell cancer, and might become a diagnosis index and treating target in clinic treatment.

annexinⅡ; esophageal squamous cell cancer; lymph node metastasis; tumor cell differentiation

264300 山東 榮成，榮成市人民醫(yī)院 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化科

高夕英，女，主任醫(yī)師，擅長(zhǎng)于消化專業(yè)，對(duì)肝膽疾病、消化道炎癥、潰瘍、出血、中毒、腫瘤等的治療 尤其突出，E-mail: qbtzsss@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.02.005

1674-4136(2015)02-0086-03

2014-08-16] [本文編輯：劉 嘉]