張 怡，李艷芹，賴麗虹，姬竹玲，任妙賢，方炳虎

（華南農業(yè)大學，廣東廣州510642）

同化激素（anabolic steroids）是一類具有環(huán)戊烷多氫菲結構的物質，常被作為蛋白同化劑濫用于畜牧生產(chǎn)中，以提高飼料轉化率，促進動物生長［1］。該類化合物在畜禽體內殘留，且在動物體內穩(wěn)定，不易分解［2］。歐盟早在21世紀80年代規(guī)定禁止該類物質作為促生長劑用于動物生長，我國農業(yè)部第176號公告明確指出禁止動物飲水和飼料中添加炔諾酮等藥物［3］。

國外已經(jīng)對牛血漿、牛尿液、動物肌肉等基質中同化激素的檢測方法進行了研究，已報道的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［4］、氣相色譜－質譜法（GC－MS）［5－6］及液相色譜－串聯(lián)質譜法（LC－MS／MS）［7－13］。目前，8種同化激素（睪酮、群勃龍、勃地龍、甲睪酮、炔諾酮、康力龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍）在豬血漿和尿液中的多殘留檢測還未見報道。由于尿液采樣方便，并能實現(xiàn)活體檢測［13］，本文采用LCMS／MS對常被非法濫用在畜牧生產(chǎn)中8種同化激素在豬血漿和尿液中的殘留進行研究，以期能建立低成本、快速、有效檢測方法，為研究可食性組織與血液、尿液的動態(tài)關系建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)為美國安捷倫公司產(chǎn)品；API 4000電噴霧－串聯(lián)四級桿質譜儀，配Analyst 4.1.5軟件為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；旋轉蒸發(fā)儀顯瑞士BUCHI公司產(chǎn)品；Milli－Q 純水機為美國Millipore公司產(chǎn)品；Agilent C18 固相萃取小柱（200mg，3mL）為美國安捷倫公司產(chǎn)品；β－葡萄糖醛苷酶為上海安普科學儀器有限公司產(chǎn)品；睪酮、群勃龍、勃地龍、甲睪酮、康力龍、丙酸睪酮、炔諾酮標準品均為德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；苯丙酸諾龍標準品為美國IL公司產(chǎn)品；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純?yōu)榈聡鳰erk公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 儲備液配制：分別準確稱取群勃龍、甲睪酮、苯丙酸諾龍，睪酮、丙酸睪酮、勃地龍、康力龍適量置于10mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成1mg／mL標準儲備液，置－20℃密閉保存?；旌蠘藴嗜芤号渲疲悍謩e從各激素藥物的儲備液中吸取1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制100μg／mL 混合標準溶液，－20℃密閉保存。使用時用初始流動性稀釋成適宜濃度的工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 色譜－質譜條件

1.2.2.1 色 譜 條 件 色 譜 柱：ZORBAX SB－Aq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流 動 相：A 相 為1mL／L甲酸水溶液，B 相為乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1min，30%～55%B；1min～3min，55%B；3min～6min，55%～98%B；6min～12min，98%B；12min～12.5min，98%～30%B；12.5min～18 min，30%B。柱溫：25℃；進樣體積：5μL。

1.2.2.2 質譜條件 電噴霧電離（ESI），正離子掃描，多反應監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓（IS）5 500 V，霧化氣壓力（GS1）65psi，輔助器流速（GS2）60 L／min，氣 簾 氣 壓 力（CUR）30 psi，離 子 源 溫 度（TEM）550 ℃，碰撞室壓力（CAD）8psi。錐孔電壓、碰撞能量及定性離子對、定量離子對等參數(shù)參見表1。

表1 8種同化激素的質譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for eight anabolic steroids

1.2.3 樣品前處理 取5mL（精確至0.1mL）試樣于50 mL 離心管中，加入乙酸銨緩沖液（調節(jié)試樣pH5.4）和β－葡萄糖醛苷酶100μL，37℃水浴12 h。冷卻至室溫，加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲提取10min，以6 000r／min離心10min。將上清液轉移梨形瓶中，重復提取1次。合并提取液，于37 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干。加1 mL 乙腈溶解殘渣，再加水3mL 稀釋，備用。備用液經(jīng)C18固相萃 取 柱 凈 化（3 mL 甲 醇、3 mL 水 活 化，3 mL 100 mL／L甲醇水淋洗），抽干后，加入3mL 乙腈洗脫，37 ℃水浴下氮氣緩慢吹干。加入2mL 300mL／L乙腈水溶解殘渣，取1mL加入等體積的正己烷，以15 000r／min離心10min，上清液過0.22μm 濾膜，待測。

1.2.4 標準曲線的制作 空白試樣按照“1.2.3”中方法處理，取適量空白上清液加入不同量的混合標準工作液，渦旋混勻，配制成1.5、2、5、10、20、50、100μg／L的基質匹配標準工作液。以待測物色譜圖的峰面積為縱坐標，相應待測物質量濃度為橫坐標，進行回歸計算，求得直線回歸方程。

1.2.5 回收率與變異系數(shù) 在2、10、50μg／L每個濃度重復5次，連續(xù)做3個批次。按照上述方法處理，計算回收率和精密度。

1.2.6 檢測限與定量限的測定 取適量的標準工作液，制 得0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、5 μg／L添加水平樣品，按照“1.2.3”方法處理，樣品經(jīng)上機檢測后。按照信噪比S／N≥3 確定檢測限（LOD），信噪比S／N≥10確定定量限（LOQ）。

2 結果

2.1 液相條件

試驗中采用乙腈－1mL／L 甲酸水作為流動相，可實現(xiàn)對8種激素類藥物的分離，并且藥物的峰形對稱，沒有拖尾現(xiàn)象，圖1為8種同化激素混合標準溶液MRM 離子流色譜圖。

2.2 線性范圍與檢測限

在1.5μg／L～100μg／L濃度內，各個藥物基質匹配標準曲線線性關系良好（r＞0.99）。按照方法規(guī)定進行前處理，上機測定。在豬血漿和尿液中，睪酮、群勃龍、勃地龍、康力龍、甲睪酮的檢測限為0.2 μg／L，丙酸睪酮、炔諾酮的檢測限為0.3μg／L；除炔諾酮定量限為1.5μg／L，其他藥物定量限均為1μg／L。

2.3 回收率和精密度

按照“1.2.3”方法，采用空白樣品添加標準溶液進行檢測，血漿中8種藥物平均回收率為72.3%～92.3%，日內標準偏差（RSD）為2.2%～14.6%，日間RSD 為5.0%～12.2%。尿液中8 種藥物平均回收率為71.5%～90.9%，日內RSD 為2.3%～13.7%，日間RSD 為3.2%～12.7%（表3）。

圖1 8種同化激素藥物的MRM 離子流圖（5μg／L）Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of eight anabolic steriods（5μg／L）

表2 8種同化激素的線性方程、檢測限和定量限Table 2 Matrix calibration curves，LOD and LOQ for eight steroid hormones

2.4 抽樣檢測

應用建立的分析方法，對30 個養(yǎng)殖場隨機采集的60份豬血漿和尿液進行測定，其中1份血漿和尿液樣品檢測出含有睪酮，血漿殘留量為1.94μg／L，尿液為3.50μg／L，血漿和尿液中未檢出其他同化激素。結果表明，該方法可用于監(jiān)控實際生產(chǎn)中該類激素的非法添加和殘留檢測。

3 討論

3.1 MS／MS特征離子的選擇

本文采用電噴霧電離，用針泵連續(xù)直接進樣，對8種物質的質譜條件進行優(yōu)化。在正離子模式下，8種激素都可形成穩(wěn)定的［M＋H］＋準分子離子，然后進行相應的子離子全掃描，以確定MRM 參數(shù)（表1）。

表3 豬血漿和尿液中8種同化激素的回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions of eight steroids hormones in plasma and urine of swine（n＝6）

3.2 樣品前處理優(yōu)化

3.2.1 酶解 外源性同化激素在動物體內的代謝情況比較復雜，目前沒有文獻明確指出8種激素動物體內代謝過程和代謝途徑。黃冬梅等［7］報道蛋白同化激素多以葡萄糖醛酸結合形態(tài)存在，因此本試驗選擇酶解。

3.2.2 提取液的選擇 試驗對比了乙醚［8］、叔丁基甲醚［9］、乙酸乙酯［10］等溶劑或混合溶液［7］的提取效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇提取樣品雜質較多，基質干擾較為嚴重；叔丁基甲醚提取時，群勃龍、炔諾酮、苯丙酸諾龍的回收率低于50%。乙酸乙酯提取時各個藥物的回收率較高，且易于濃縮，最終選擇乙酸乙酯作為提取液。

3.2.3 固相萃取柱的選擇 考慮到尿液酶解后產(chǎn)物相對較多，本試驗采用目前最常用的凈化方式SPE凈化［7－13］。由于該類物質為中等極性或者弱極性，多數(shù)文獻采用HLB 和C18固相萃取小柱。Wozniak B等［11］將尿液直接通過C18固相萃取小柱和NH2固相萃取小柱富集、凈化，以減少基質干擾。王旭峰等［12］將尿液直接冷凍、復溶后經(jīng)MCX 小柱凈化，上機檢測。

本試驗對比了8 種同化激素在HLB 和C18兩種固相萃取小柱上吸附效果，發(fā)現(xiàn)各個藥物在C18固相萃取柱上回收率均較高，同時考慮其成本相對較低，最終選擇C18柱。

3.3 基質效應的消除

利用ESI離子源對目標物進行分析時會產(chǎn)生較強的基質效應，試驗中采用在空白提取液中加入不同濃度的混合標準溶液，按照已定的色譜、質譜條件進行檢測，與相應流動相（純溶劑）中待測物的離子強度進行比較。結果發(fā)現(xiàn)8種同化激素在血漿和尿液中的響應值均比標準溶液低，存在基質抑制效應。為消除或減少基質效應，本試驗采用空白基質匹配標準校正定量［13－14］。

3.4 實際樣品檢測

應用建立的分析方法，對30 個養(yǎng)殖場隨機采集的60份豬血漿和尿液進行測定，其中1份血漿和尿液樣品睪酮結果為陽性，血漿和尿液中未檢出其他同化激素。說明該方法對監(jiān)控實際生產(chǎn)中該類激素的非法添加有重要的意義。

本試驗建立了豬血漿和尿液中睪酮、群勃龍、勃地龍、康力龍、甲睪酮、炔諾酮、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍8種同化激素的LC－MS／MS檢測方法，該方法前處理簡單、方便，為監(jiān)控豬生產(chǎn)中該類物質的非法添加使用提供一定的技術支持。

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