劉玉輝，賴金倫，寇明明，鄧明亮，劉瑞寧，陳穎鈺，2，胡長敏，2＊，郭愛珍，2＊

（1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢430070；2.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢430070）

乳腺炎是嚴重危害人類及動物健康的常見疾病。奶牛乳腺炎被列為“奶牛三大疾病”之首，造成了奶牛業(yè)嚴重的經濟損失，全世界約有2.2億頭奶牛，其中約有三分之一的奶?；加懈鞣N類型乳腺炎［1－2］。

建立小鼠原代乳腺上皮細胞（mouse mammary epithelial cells，MMECs）和奶牛原代乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）體外分離培養(yǎng)體系是開展乳腺炎致病機制研究工作的基礎。Wang W 等［3］建立MMECs培養(yǎng)體系，研究中藥厚樸酚調控脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導MMECs炎癥反應的機制。Olga W 等［4］也建立了BMECs培養(yǎng)體系研究病原菌與BMECs的相互作用。通過建立MMECs和BMECs體外培養(yǎng)體系模擬體內試驗過程，既增加了試驗的便利性，也減少了試驗成本；同時可為乳腺生長發(fā)育、泌乳機制及乳腺生物反應器的研究提供參考。

1957年Lasfargues等首次實現了MMECs的直接培養(yǎng)，成功建立了BMECs 細胞系BMGE＋HM、BMGE＋H 及EMGE－H［5］。張以濤等［6－7］分別研究了MMECs和BMECs體外培養(yǎng)特性，但有關MMECs及BMECs的分離培養(yǎng)、生長特性的比較研究尚未見報道。在本研究中，采用改良混合酶消化結合差速貼壁法分別從小鼠和奶牛乳腺中提取出高純度的MMECs及BMECs，進行兩種細胞的體外培養(yǎng)傳代和凍存復蘇試驗，對比了MMECs和BMECs的分離、培養(yǎng)方法、生長特性、細胞傳代和復蘇性狀，為選擇及建立合適的MMECs和BMECs體外模型，以及開展乳腺相關功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 妊娠后期SPF 昆明鼠購自湖北省疾病控制中心，泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺組織采自湖北省某獸醫(yī)站。

1.1.2 主要試劑及耗材 膠原酶（Collagenase）Ⅰ和Ⅱ為Solarbio公司產品；2.5g／L 胰蛋白酶－0.2 g／L乙二胺四乙酸（Trypsin－EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）為Gibico產品；胰島素（Insulin）、轉鐵蛋白（Transferrin）、二甲基亞砜（DMSO）、兩性霉素B 和慶大霉素為Sigma公司產品；DMEM／F12、青鏈霉素雙抗（Penicilin－Streptomycin Solution）為Hyclone公司產品；表皮生長因子（EGF）為SinoBiological公司產品；兔源的角蛋白18多克隆抗體（Rabbit Anti－Cytokeratin18）為Bioss公司生產；FITC 標記的羊抗兔二抗為Southern Biotech公司 產 品；T25、T75 細 胞 培 養(yǎng) 瓶12 孔、24孔細胞培養(yǎng)板為Lab Serv公司產品。

1.1.3 細胞消化液、培養(yǎng)液及凍存液 提取細胞時所用的消化液為2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA與膠原酶Ⅰ、Ⅱ型等比例混合液，Ⅰ、Ⅱ型膠原酶均配制為2mg／mL 的工作液（100 mg膠原酶添加5 mL胎牛血清和45mL DMEM／F12）。細 胞生長培養(yǎng)液：基礎培養(yǎng)液為DMEM／F12 添加100 mL／L FBS 10 mL／L Penicilin－Streptomycin Solution，5 ng／mL EGF，5μg／mL Insulin，5μg／mL Transferrin；凍存培養(yǎng)液：900 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO。

1.2 方法

1.2.1 MMECs的分離與純化 取健康妊娠后期SPF昆明鼠，斷頸處死后在750 mL／L 酒精中浸泡60s，無菌采集小鼠倒數第2對乳腺，避開血管且去除淋巴結后稱重；將采集到的乳腺組織放入含20 mL／L雙抗的PBS中，清洗干凈后置小燒杯中剪碎至糊狀，隨后轉入錐形瓶中密封，37℃、110r／min恒溫振蕩培養(yǎng)消化約2h～3h至無成塊組織（每克組織加入4mL Trypsin－EDTA 及4mL 膠原酶Ⅰ、Ⅱ等比例混合液，消化時間根據消化組織量而異）；將消化后的勻漿液轉入15 mL 無菌離心管中25℃、250r／min離心5min。收集離心后的沉淀，加入適量含100mL／L FBS的DMEM／F12，用200目細胞篩過濾去除未消化組織塊。收集濾液，經相同條件離心后棄上清，加入適當2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA 混合液重懸，作用2 min使細胞分散為單個細胞，隨后加入5mL含100mL／L FBS的DMEM／F12終止反應。反復離心3次清洗沉淀后加入適當培養(yǎng)液重懸，用400目細胞篩過濾后離心。沉淀中加入適量細胞生長液重懸后接種到細胞培養(yǎng)皿中差速貼壁1h，去除成纖維細胞，此操作重復2次，最后將細胞計數后接種于細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

1.2.2 BMECs的分離與純化 健康泌乳中期荷斯坦奶牛屠宰時，乳腺皮膚經酒精消毒后用無菌手術刀切開，避開血管、脂肪及淋巴組織，剪取約5g腺泡處乳腺組織放入含2.5μg／mL兩性霉素B及50 μg／mL慶大霉素的PBS中，置冰盒中帶回實驗室，提取步驟與1.2.1 MMECs相同，但奶牛乳腺組織振蕩消化時間約4h～4.5h。

1.2.3 MMECs及BMECs的免疫熒光鑒定 將分離的MMECs接種于加有爬片的12孔板中培養(yǎng)至單層，以小鼠乳腺成纖維細胞作陰性對照；吸棄細胞生長液，PBS清洗3次后用40mL／L 多聚甲醛固定30min；同上清洗后取50 mL／L BSA 溶液封閉30 min；封閉完成后吸干封閉液，并將細胞充分浸泡于兔源角蛋白18多克隆抗體（稀釋倍數為1∶200）中，4℃孵育過夜；PBS清洗細胞后加入FITC 標記的羊抗兔二抗（稀釋倍數為1∶100），室溫避光孵育1h；PBS清洗除去二抗，Hoechst 33342 室溫避光染色10min；抗熒光猝滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

BMECs的固定、染色步驟及免疫熒光鑒定方法與MMECs的鑒定方法相同，同時設定奶牛乳腺成纖維細胞作陰性對照。

1.2.4 MMECs及BMECs的傳代 MMECs及BMECs生長匯合至單層時，用適量2.5g／L Trypsin－EDTA，37℃消化10min～15min，以1∶2的比例進行細胞傳代，補加生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 細胞生長曲線的繪制 將分離純化的MMECs和BMECs以1×104個／mL的密度接種于24孔板中，然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換液1次，采用細胞計數儀連續(xù)8d進行細胞計數。以時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪圖，細胞數取3個孔的平均值。

1.2.6 MMECs 及BMECs 的 凍 存 與 復 蘇MMECs及BMECs 凍存前同細胞傳代方法，見

1.2.4 。取消化后細胞，25℃、1 000r／min 離心5 min，收集細胞；用1.1.3所示細胞凍存液將細胞分裝至1.5mL凍存管中，每管1mL，液氮中保存。解凍時，從液氮中取出MMECs及BMECs凍存管，37℃水浴快速解凍細胞，而后加入細胞生長培養(yǎng)液，25℃、1 000r／min離心5min，收集細胞并接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2 結果

2.1 MMECs與BMECs分離、純化結果

分別應用改良的混合酶消化結合差速貼壁法成功提取了高純度的MMECs和BMECs。盡管兩種細胞培養(yǎng)體系的建立步驟類似，但在取材部位、清洗液的選擇、清洗次數及消化時間等方面仍存在明顯差異（表1）。

2.2 原代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

2.2.1 原代MMECs培養(yǎng)特性 根據MMECs與小鼠乳腺成纖維細胞貼壁速度的差異，經兩次差速貼壁法將MMECs與小鼠乳腺成纖維細胞分離。分離后的細胞培養(yǎng)3d左右，分別得到單一的MMECs與小鼠乳腺成纖維細胞。倒置顯微鏡下觀察，MMECs呈現典型的鋪路石樣外觀，且細胞連接緊密，間隙清晰（圖1a）；當MMECs長滿后繼續(xù)培養(yǎng)會出現典型的穹頂狀結構，穹頂內仍有一層MMECs（圖1b）。分離出的小鼠乳腺成纖維細胞呈典型的梭形（圖1c）。

表1 MMECs與BMECs分離方法比較Table 1 Comparison of separation methods between MMECs and BMECs

圖1 MMECs及小鼠乳腺成纖維細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察（10×）Fig.1 Morphology of MMECs and mouse mammary fibroblasts（10×）

2.2.2 原代BMECs培養(yǎng)特性 通過改良混合酶消化結合差速貼壁法，分別獲得BMECs和奶牛成纖維細胞。倒置顯微鏡下觀察，BMECs輪廓清晰，排列緊密，呈現典型的鵝卵石樣外觀。對BMECs進行細胞形態(tài)跟蹤觀察評價，原代BMECs呈島嶼狀生長，由中間向四周擴散，細胞生長6d匯合成單層（圖2A）。奶牛乳腺成纖維細胞排列緊密，細胞形態(tài)為梭形（圖2B）。

2.3 傳代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

2.3.1 MMECs傳代觀察 將MMECs以1∶2的比例進行傳代，傳代細胞并未像原代MMECs出現鋪路石樣外觀，細胞間隙變大，排列不規(guī)則且不能匯合成單層（圖3）。

2.3.2 BMECs傳代觀察 將BMECs以1∶2進行傳代，傳代后2d細胞即匯合成單層，且傳代細胞與原代BMECs形態(tài)一致，細胞生長狀態(tài)良好（圖4a、圖4b）。當BMECs傳至第9代時，細胞出現了空泡與老化現象（圖4c、圖4d），死細胞增多。

2.3.3 細胞生長曲線 以1×104個／mL 的細胞數將純化后的MMECs和BMECs（第2代）接種于24孔板中，通過細胞計數得出的生長曲線見圖5。MMECs在接種到24 孔板中后，細胞出現生長緩慢，不能匯合成單層細胞狀態(tài)，剛開始貼壁的細胞在隨后的生長過程中逐漸死亡，這與上述MMECs不能傳代相符；BMECs的生長曲線顯示：0～3d為細胞生長的滯留期，細胞處在適應環(huán)境的過程，從第4天開始細胞進入對數生長期，直至第7天，之后細胞生長步入平臺期。

2.4 MMECs與BMECs的凍存與復蘇

使用相同的凍存液凍存MMECs和BMECs，復蘇后的細胞均能匯合為單層，且生長狀態(tài)良好。但MMECs只能凍存原代細胞，而BMECs可對傳代細胞進行凍存（圖6）。

2.5 MMECs與BMECs免疫熒光鑒定

MMECs與BMECs經兔源角蛋白18多克隆抗體孵育后加入FITC 標記的熒光二抗，同時用Hoechst33342標記細胞核，置激光顯微鏡下觀察。角蛋白18特異性存在于MMECs與BMECs的胞質中，經免疫熒光染色后胞質呈現綠色，細胞核呈藍色（圖7a、圖7c）。小鼠及奶牛乳腺成纖維細胞缺乏角蛋白18，僅細胞核呈現藍色熒光（圖7b、圖7d）。

3 討論

3.1 MMECs和BMECs的分離鑒定

圖2 BMECs及奶牛乳腺成纖維細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察（10×）Fig.2 Morphology of BMECs and bovine mammary fibroblasts（10×）

圖3 傳代后的MMECs形態(tài)觀察（10×）Fig.3 Morphology of passaged MMECs（10×）

在原代乳腺上皮細胞提取方法上，人們大多采用先胰酶粗消化后再用膠原酶消化的方法［8－9］，由于乳腺組織中含有多種細胞，酶消化法提取出來的細胞多為乳腺上皮細胞和成纖維細胞的混合物，因此仍需對提取所得細胞混合物進一步純化。多項研究表明，成纖維細胞較乳腺上皮細胞對胰酶的敏感性高，在貼壁培養(yǎng)時不僅貼壁時間短，且貼壁后更易被胰酶消化。因此可根據成纖維細胞和乳腺上皮細胞特性的差異，采用差時消化和差速貼壁的方法對乳腺上皮細胞進行純化［10］。大多數人在純化方法上選擇根據兩種細胞對胰酶的敏感性差異開展純化［11］，由于該方法是在培養(yǎng)細胞的過程中進行的，直接獲得的乳腺上皮細胞純度不高，且胰酶消化時間的不確定性也增加了純化的難度。

圖4 傳代BMECs形態(tài)觀察Fig.4 Morphology of passaged BMECs

圖5 小鼠和奶牛乳腺上皮細胞的生長曲線Fig.5 Growth culture of MMECs and BMECs

圖6 經凍存復蘇后的細胞形態(tài)（10×）Fig.6 Cell morphology after cryopreservation and resuscitation

圖7 角蛋白18免疫熒光鑒定MMECs與BMECsFig.7 Cytokeratin18expression in MMECs and BMECs by immunofluorescence staining analysis

本研究中，初始我們采用胰酶與膠原酶分段消化的方法分離MMECs，得到細胞成纖維細胞與乳腺上皮細胞的混合物，然后根據其對胰酶敏感性不同進行純化，考慮到純化時胰酶量差異、消化時間的不確定性，以及胰酶反復作用造成乳腺上皮細胞損傷，隨后我們對乳腺上皮細胞的提取方法做了一些改良，一是在酶消化時采用胰酶與膠原酶Ⅰ、Ⅱ等量混合的方法進行消化，直至將乳腺組織消化成無明顯可見大顆粒為止。改進后的消化方法不僅減少了試驗步驟，增加了試驗的便捷性，而且混合酶同時消化乳腺組織，可以使乳腺組織消化更徹底充分，更容易獲得目的細胞。二是直接采用差速貼壁法，將混合酶消化后的兩種細胞混合物直接培養(yǎng)，根據成纖維細胞先貼壁的特性將其去除，從而得到高純度的乳腺上皮細胞。

角蛋白是乳腺上皮細胞重要的標志性蛋白，乳腺上皮細胞中的細胞骨架蛋白主要以角蛋白－7、8和18為主，而成纖維細胞中缺少角蛋白－18［12］。本研究通過角蛋白18 免疫熒光染色成功鑒定MMECs和BMECs。

3.2 MMECs和BMECs生長特性

MMECs和BMECs的形態(tài)存在差異，MMECs偏大，細胞趨向于多角形，細胞間排列緊密，細胞間隙小，呈鋪路石樣外觀；BMECs體積稍小，呈現鵝卵石樣外觀（圖1、圖2）。另外，BMECs培養(yǎng)初期細胞量少，后期細胞增殖快（圖2），可見BMECs分裂增殖能力較MMECs強。

3.3 MMECs和BMECs的傳代特性

在本研究中，MMECs傳代后老化，且不能長滿（圖3），這與易瓊等描述的MMECs 可以傳代不符［13］，分析原因可能是乳腺上皮細胞的生長特性為形成乳腺細胞團并以團塊擴張的形式生長［14］，MMECs傳代減少了細胞量，以1∶2傳代的細胞密度仍然較低，導致細胞團塊不能形成；另外，推測MMECs傳代過程中缺失了上皮細胞的某些成分或是生長培養(yǎng)基不能滿足傳代細胞的營養(yǎng)供應，從而影響其分化增殖［15］。奶牛BMECs可以傳至第9代，但后續(xù)傳代時細胞出現明顯的易老化特征，細胞間形成空泡，細胞不能匯合成單層（圖4c、4d），這符合原代細胞的生長特性。

同時純化后的MMECs和BMECs的生長曲線更進一步說明了MMECs在細胞密度低的情況下不能生長，分裂增殖能力差；而BMECs的分裂增殖能力較強，細胞的生長曲線呈現典型的S型，這與李文清等［16］描述相符。

3.4 MMECs和BMECs的凍存與復蘇

本研究中，根據文獻報到的凍存液（900 mL／L FBS＋100mL／L DMSO）進行MMECs和BMECs的凍存［17］，復蘇凍存后的細胞生長良好。張以濤等以DMEM／F12∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1的凍存液成功凍存了MMECs，Danowski K 等［18］也以同樣比例的凍存液有效凍存了BMECs。由于MMECs不能傳代，因此直接對原代MMECs進行凍存，所需細胞量大。而BMECs可用傳代細胞進行凍存。

4 小結

本研究成功建立原代MMECs與BMECs細胞培養(yǎng)體系，同時比較了MMECs與BMECs的分離方法、體外生長培養(yǎng)、傳代及凍存與復蘇特性，但對于MMECs不能傳代的原因仍需作進一步研究。開展培養(yǎng)原代乳腺上皮細胞及建立乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系的研究，不僅有助于建立乳腺生物反應器及體外乳腺疾病研究模型，同時也為體外研究乳腺功能奠定了理論基礎。

［1］ Seegers H，Fourichon C，Beaudeau F.Production effects related to mastitis economics in dairy cattle herds［J］.Vet Res，2003（34）：475－491.

［2］ 周緒正，張繼瑜，李劍勇，等.“乳源康”對奶牛乳房炎的療效研究［J］.動物醫(yī)學進展，2007，28（2）：44－47

［3］ Wang W，Liang D J，Song X J，et al.Magnolol inhibits the inflammatory response in mouse mammary epithelial cells and a mouse mastitis model［J］.Inflammation，2015，38（1）：16－26

［4］ Wellnitz O，Kerr D E.Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection［J］.Vet Immunol Immunopathol，2004，101（3）：191－202

［5］ 張 燕，杜衛(wèi)華，郝海生，等.哺乳動物乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，36（10）：34－38

［6］ 張以濤，李慶章.小白鼠乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及形態(tài)學變化［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（4）：12－13

［7］ 王 亨，吳培福，邱昌偉，等.荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：41－42

［8］ Huijps K，Lam T J，Hogeveen H.Costs of mastitis：facts and perception［J］.Dairy Res，2008，75（1）：113–120.

［9］ 王 亨，孟 霞，邱昌偉，等.脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞先天性免疫反應［J］.中國獸醫(yī)學報，2010，30（3）：399－400.

［10］ Hensen S M.Use of bovine primary mammary epithelial cells for the comparison of adherence and invasion ability of Staphylococcus aureus strains［J］.J Dairy Sci，2000，83（3）：419－420.

［11］ 易 瓊，張 毅，李圓方，等.小鼠乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)［J］.山地農業(yè)生物學報，2011，30（5）：425－428.

［12］ 耿麗晶，張以濤，林 葉，等.小鼠乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系的建立及Heregulin－α的調控作用［J］.中國科學：生命科學，2011，41（4）：296－303.

［13］ 易 瓊，王 魯，李圓方，等.改良型混合酶消化法培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（50）：9335－9338.

［14］ 張以濤.小鼠乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系的建立及初步應用［D］.黑龍江哈爾濱：東北農業(yè)大學基礎獸醫(yī)學，2007.

［15］ 畢 琳，李 健，王中乾，等.小鼠乳腺上皮細胞體外原代培養(yǎng)方法 研 究 進 展［J］.安 徽 農 業(yè) 科 學，2010，38（7）：3488－3491.

［16］ 李文清，王加啟，南雪梅，等.奶牛乳腺上皮細胞的不同培養(yǎng)方法比較及激素和細胞因子對β－酪蛋白mRNA 表達的誘導［J］.動物營養(yǎng)學報，2014，26（9）：2607－2614.

［17］ Hu H，Wang J Q，Bu D P，et al.In vitro culture and characterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow［J］.PLoS One，2009，4（11）：7636：7643.

［18］ Danowski K，Sorg D，Gross J，et al.Innate defense capability of challenged primary bovine mammary epithelial cells after an induced negative energy balance in vivo［J］.Czech J Anim Sci，2012，57（5）：207－219.