徐小娟 劉英志 陳碧蓮 林靜俐

近幾十年來，利用氟化物防齲已在世界范圍得到廣泛應(yīng)用，大量流行病學(xué)研究已表明氟化物的防齲效果確切，可有效地降低齲病的發(fā)生率，故氟化物防齲被稱為二十世紀(jì)預(yù)防口腔醫(yī)學(xué)對(duì)人類最大的貢獻(xiàn)之一[1-2]。隨著其應(yīng)用范圍及時(shí)間的不斷擴(kuò)大，其弊端逐漸顯現(xiàn)出來，在防齲的同時(shí)減少氟化物使用的濃度及頻率，從而降低氟化物的毒性作用已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[3-4]。

五倍子是近年來研究較多的中藥防齲藥物，其主要成分為水解性鞣質(zhì)與沒食子鞣酸，具有結(jié)合鈣和蛋白的特性，可抑制變形鏈球菌等致齲菌的生長(zhǎng)，減少牙菌斑的聚集，抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而影響致齲菌生長(zhǎng)代謝；同時(shí)也有促進(jìn)早期釉質(zhì)齲再礦化的作用[5-7]。

筆者前期的體外研究發(fā)現(xiàn)氟化物可抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝活動(dòng)，但抑菌濃度相對(duì)較高[8-9]。本研究中筆者研究氟化鈉與五倍子水提取物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)變鏈菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝的影響，以期探明五倍子是否有抑制變鏈菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝的作用，并進(jìn)一步研究氟化鈉與五倍子聯(lián)合應(yīng)用是否可產(chǎn)生協(xié)同的防齲效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和材料 電子分析天平、紫外分光光度計(jì)、多功能離子計(jì)/pH計(jì)、凈化工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、干熱鼓風(fēng)干燥箱、漩渦振蕩器。

1.2 細(xì)菌來源 Ingbritt（血清c型）變形鏈球菌（以下簡(jiǎn)稱變鏈菌），由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教研室提供。

1.3 培養(yǎng)基制備 采用含5%蔗糖的胰蛋白酶水解物－大豆液體培養(yǎng)基（TS），培養(yǎng)基主要成分為：胰蛋白酶、大豆胨、酵母提取物、氯化鈉、鹽酸半胱氨酸及蔗糖，以氫氧化鈉將培養(yǎng)基pH值調(diào)到7.6，高壓蒸汽滅菌[10]。所用試劑均為分析純。

1.4 氟化鈉的配制 將NaF粉末置干燥箱110 ℃烘干2 h，冷卻后稱取5 g，加去離子水至50 mL，配制10%NaF溶液，采用逐級(jí)稀釋法分別將溶液稀釋到0.2%、0.1%，濾過滅菌。

1.5 五倍子水提取物 取適量五倍子原藥材，敲開后去除蟲垢及雜質(zhì)，沖洗、清潔、干燥，粉碎后過28目篩，稱取50 g，加無(wú)離子水100 mL，室溫下浸泡24 h，過濾4000 r/s離心5 min，取上清液，共離心2次。將上清液冷凍干燥，所得干粉視為五倍子水提取物純品應(yīng)用，根據(jù)需要配制不同濃度水提取物溶液，分裝60Co照射后4 ℃冰箱備用。將五倍子凍干粉按液體二倍稀釋法溶于含5%蔗糖的TS液體培養(yǎng)基中，終末濃度分別為10、5、2.5 mg/mL。

1.6 方法 （1）菌液復(fù)蘇：取100 mL TS液體培養(yǎng)基，加入50 μL凍存的標(biāo)準(zhǔn)菌液，90% N2、10% CO2條件下，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，獲得濃菌液。（2）接種培養(yǎng)：取10 mL的無(wú)菌培養(yǎng)管120支，分為12組，對(duì)照組1組，實(shí)驗(yàn)組11組，每組各10支。在每組各管內(nèi)先分別加入液體培養(yǎng)基4 mL，濃菌液0.5 mL，然后對(duì)照組加入無(wú)菌去離子水，實(shí)驗(yàn)組各組分別加入0.1%、0.2%NaF溶液及10、5、2.5 mg/mL五倍子水提取物共5 mL，使各組內(nèi)實(shí)驗(yàn)試劑含量分別為：①0.01%NaF；②0.01% NaF+0.25 mg/mL五倍子；③0.01%NaF+0.5 mg/mL五倍子；④0.01% NaF+1 mg/mL五倍子；⑤0.02% NaF；⑥0.02% NaF+0.25 mg/ml五倍子；⑦0.02% NaF+0.5 mg/mL五倍子；⑧0.02%NaF+1 mg/mL五倍子；最后三組各含0.25、0.5及1 mg/mL五倍子。將各管振蕩混勻，將培養(yǎng)管置90%N2、10% CO2條件下，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。（3）檢測(cè)：將培養(yǎng)液振蕩混勻，取3 mL于分光光度計(jì)下測(cè)各管菌懸液在540 nm處光密度值（OD值）；剩下的2 mL再次充分混勻，以復(fù)合pH電極測(cè)試其pH值，并計(jì)算培養(yǎng)前后培養(yǎng)液pH的變化（△pH）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x-±s）表示，單因素方差分析比較各組的OD值及pH變化值（△pH），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 以O(shè)D值反映細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。與對(duì)照組相比，在含NaF及五倍子的各培養(yǎng)管中，細(xì)菌的生長(zhǎng)均受抑制，培養(yǎng)液的OD值較對(duì)照組降低，且隨著NaF及五倍子濃度的升高，培養(yǎng)液中OD值呈濃度依賴性減小，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)NaF與五倍子聯(lián)合應(yīng)用時(shí)OD值變化與各對(duì)應(yīng)濃度單獨(dú)應(yīng)用時(shí)相比略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 不同濃度NaF與五倍子水提取物對(duì)變鏈菌生長(zhǎng)的影響（OD值：x-±s）

2.2 對(duì)變鏈菌產(chǎn)酸代謝的影響 以各管培養(yǎng)液在培養(yǎng)前后pH的變化（△pH）來反映變鏈菌的產(chǎn)酸代謝情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組培養(yǎng)基pH明顯下降，表明該管內(nèi)變鏈菌的產(chǎn)酸代謝活躍；而含NaF及五倍子的各培養(yǎng)管內(nèi)變鏈菌的產(chǎn)酸則受到抑制，培養(yǎng)前后培養(yǎng)基pH的變化減小，且隨著濃度的升高，其△pH呈降低趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)NaF與五倍子聯(lián)合應(yīng)用時(shí)△pH變化與各對(duì)應(yīng)濃度單獨(dú)應(yīng)用時(shí)相比略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 2。

表2 不同濃度NaF與五倍子水提取物對(duì)變鏈菌產(chǎn)酸代謝的影響（△pH：x-±s）

3 討論

自上世紀(jì)40年代Dean等[1]首次提出氟化物防齲作用以來，學(xué)者們對(duì)氟化物作為防齲藥物在使用方法、給藥形式以及防齲機(jī)理等方面都進(jìn)行了廣泛深入研究，在應(yīng)用氟化物有效預(yù)防齲病的同時(shí)，氟牙癥、氟中毒等不良影響也成為困擾學(xué)者們的一個(gè)問題[4，11]。

近年來，中藥防齲逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[12-13]。已有研究表明五倍子及其主要成分鞣酸具有抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，抑制細(xì)菌合成胞外基質(zhì)的形成，從而抑制變鏈菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、黏附的能力；另外，還能防止釉質(zhì)表面脫礦、提高釉質(zhì)抗酸蝕的能力，其效果與氟化鈉相當(dāng)[5-7，14-15]。

本研究旨在探討氟化物與五倍子水提取物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝的影響，實(shí)驗(yàn)中的選用了NaF的濃度分別為0.01%和0.02%，是因?yàn)槟壳俺Ｓ玫模徽J(rèn)為較為安全的氟化物漱口液的濃度一般為114 ppm和228 ppm，將五倍子水提取物與接近安全閾值的氟化物聯(lián)合應(yīng)用得出的結(jié)論更能指導(dǎo)今后的臨床應(yīng)用。有研究表明當(dāng)五倍子水提取物的濃度>0.5 mg/mL時(shí)可抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝活動(dòng)。在本實(shí)驗(yàn)濃度下五倍子的抑菌作用略弱于氟化物，但兩者的抑菌作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示五倍子是有效的防齲藥物，在齲病預(yù)防中具有一定的應(yīng)用前景，實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)其與氟化物具有協(xié)同的防齲效應(yīng)，兩者之間是否有相互的協(xié)同效應(yīng)還待對(duì)更多不同濃度的聯(lián)合應(yīng)用、五倍子其他劑型（如煎劑，甲醇或乙醇提取物等）以及其對(duì)牙體硬組織脫礦及再礦化的影響等方面進(jìn)行進(jìn)一步深入研究[16-17]。筆者相信，鮮有副作用且產(chǎn)量豐富的天然藥物五倍子，其在防治齲病的領(lǐng)域中的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

[1] Dean H T，Arnold F A，Jay P，et al.Studies on mass control of dental caries through fluoridation of the public water supply[J].Public Health Rep，1950，65（43）：1403-1408.

[2]高永志，陳姍姍，殷志遠(yuǎn).氟凝膠與氟泡沫防齲效果的臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（20）：99.

[3]郭媛珠，凌均棨，陳成章.氟與口腔醫(yī)學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2000：58-88，181-199.

[4]葉文迪，陳秀鳳.2011年南安市地方性氟中毒監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（36）：81-82.

[5] Deng M，Dong X，Zhou X，et al.Characterization of dentin matrix biomodified by Galla chinensis extract[J].J Endod，2013，39（4）：542-547.

[6] Huang X，Cheng L，Exterkate R A，et al.Effect of pH on Galla chinensis extract's stability and anti-caries properties in vitro[J].Arch Oral Biol，2012，57（8）：1093-1099.

[7] Cheng L，Exterkate R A，Zhou X，et al.Effect of Galla chinensis on growth and metabolism of microcosm biofilms[J].Caries Res，2011，45（2）：87-92.

[8]徐小娟，劉魯川，王芳，等.四種方式用氟對(duì)牙菌斑產(chǎn)酸力的影響[J].廣東牙病防治，2006，14（1）：45-46.

[9]徐小娟，劉英志，林靜俐.氟化物對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸影響的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，16（8）：978-980，1003.

[10]肖曉蓉.口腔微生物學(xué)及實(shí)用技術(shù)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)/協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993：172-254.

[11]陳安良，梁惠芳，胡國(guó)昌，等.廣州市環(huán)境氟與自來水氟化的討論意見[J].廣州醫(yī)藥，1984，15（5）：6-10.

[12]席清平，唐榮銀，岳曉紅，等.五倍子對(duì)體內(nèi)菌斑生物膜活性影響的體外研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（2）：203-206.

[13]肖悅，劉天佳，黃正蔚，等.茶多酚對(duì)口腔細(xì)菌致齲力影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣東牙病防治，2002，10（1）：4-6.

[14] Guo B，Que K H，Jing Yang，et al.Effect of Galla chinensis on the remineralization of two bovine root lesions morphous in vitro[J].Int J Oral Sci，2012，4（3）：152-156.

[15] Zhang L，Xue J，Li J，et al.Effects of Galla chinensis on inhibition of demineralization of regular bovine enamel or enamel disposed of organic matrix[J].Arch Oral Biol，2009，54（9）：817-822.

[16] Huang X L，Liu M D，Li J Y，et al.Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect of its main component（s） on the prevention of enamel demineralization in vitro[J].Int J Oral Sci，2012，4（3）：146-151.

[17] Cheng L，Li J，Hao Y，et al.Effect of compounds of Galla chinensis on remineralization of enamel surface in vitro[J].Arch Oral Biol，2010，55（6）：435-440.