馬云超，馬珊珊，郭繼業(yè)，宋 冰，丁孝營(yíng)，徐珊珊

(1.吉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林市社會(huì)福利院，吉林 吉林 132012)

喜樹(shù)堿(PT)為具有內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的喹啉類生物堿，繼1966年Wall等首次從喜樹(shù)植物中分離出喜樹(shù)堿之后，人們對(duì)喜樹(shù)堿的生物和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了大量的研究，主要是針對(duì)抗腫瘤研究領(lǐng)域。喜樹(shù)堿的抗癌作用，起初認(rèn)為是喜樹(shù)堿通過(guò)抑制核酸合成，導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)DNA降解，近年來(lái)研究結(jié)果否定了這一觀點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)喜樹(shù)堿主要是通過(guò)抑制癌細(xì)胞DNA復(fù)制酶，阻礙癌細(xì)胞的增殖。1988年又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)喜樹(shù)堿主要是通過(guò)阻斷DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisonmerase I)合成，發(fā)揮細(xì)胞毒性的獨(dú)特抗癌機(jī)理[1]。

傳統(tǒng)工藝上，多用氯仿或氯仿/甲醇提取乙醇萃取液中的喜樹(shù)堿，由于氯仿的高溶劑毒性及低選擇性，導(dǎo)致氯仿萃取物中喜樹(shù)堿含量較低且化合物復(fù)雜，給喜樹(shù)堿精制和分離帶來(lái)困難。

大孔樹(shù)脂是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種高吸附性的有機(jī)高聚物，它包括大孔吸附樹(shù)脂和大孔離子交換樹(shù)脂[2]。大孔吸附樹(shù)脂不含有離子交換基團(tuán)，是以苯乙烯和丙烯酸酯為單體，加入交聯(lián)劑和致孔劑，相互交聯(lián)聚合而成多孔骨架結(jié)構(gòu)，其吸附原理是利用自身巨大的表面積，通過(guò)范德華力與被吸附組分發(fā)生物理性作用，并依據(jù)化合物相對(duì)分子質(zhì)量大小及吸附力強(qiáng)弱的差別，達(dá)到分離提純的目的[3]。與其它柱層析吸附劑相比，大孔樹(shù)脂具有吸附容量大、物理穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大、易被有機(jī)溶劑選擇性洗脫、再生性良好的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)選用5種非/弱極性大孔吸附樹(shù)脂，通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)，對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行篩選。結(jié)合動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)對(duì)樹(shù)脂純化工藝以及樹(shù)脂再生性進(jìn)行研究，從而確定利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)天然產(chǎn)物中喜樹(shù)堿分離的工業(yè)技術(shù)可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

所用溶劑除乙腈外均為分析純；乙腈為高效液相色譜純；蒸餾水及超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.8%，喜樹(shù)葉采自浙江桐廬浙江林學(xué)院培植基地四年生喜樹(shù)；D101、D201、D402、AB-8、X-5大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)于天津南開(kāi)大學(xué)化工廠。

LC-6A高效液相色譜系統(tǒng)、UV-2450紫外檢測(cè)器、AUY220型電子分析天平：日本島津株式會(huì)社；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-S14型恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DGG-9240B型電熱恒溫干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 喜樹(shù)堿樣品液的制備與含量測(cè)定

稱取喜樹(shù)葉干粉，置于70 ℃的恒溫水浴中，用體積分?jǐn)?shù)65%的甲醇水溶液，料液比1∶10，回流提取1 h，37 ℃下減壓濃縮，得到喜樹(shù)堿的樣品液。HPLC測(cè)定ρ(樣品液)。

1.2.2 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理與再生

將D101、D201、D402、AB-8、X-5 5種大孔吸附樹(shù)脂用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡2 d，傾去上浮物后抽濾，重復(fù)操作，直至乙醇洗滌液澄清且加水不產(chǎn)生乳白色渾濁現(xiàn)象，然后用大量蒸餾水浸沒(méi)保存，備用。

1.2.3 大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附/解吸實(shí)驗(yàn)

取濕樹(shù)脂各2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加入0.175 mg/mL的喜樹(shù)堿樣品液100 mL，25±2 ℃震蕩24 h。吸附平衡后，取清液1 mL，甲醇定容至10 mL，HPLC測(cè)定ρ(吸附殘液)。

將吸附后的樹(shù)脂洗滌抽濾，然后置于150 mL三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震蕩解吸24 h，解吸平衡后，抽濾，并用少量乙醇洗滌，合并濾液及洗滌液，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇定容至100 mL，HPLC測(cè)定ρ(解吸液)。

計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

其中：ρ1為 解吸液質(zhì)量濃度；ρ0為吸附液質(zhì)量濃度；ρr為吸附殘液質(zhì)量濃度；V為吸附液體積；V1為解吸溶劑體積；m為樹(shù)脂的干重。

1.2.4 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究

1.2.4.1 大孔吸附樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

取AB-8樹(shù)脂2.5 g，加入ρ(喜樹(shù)堿)為0.175 mg/mL的溶液100 mL，靜態(tài)吸附10 h，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h，各移取上清液1 mL，HPLC測(cè)定吸附殘液中ρ(喜樹(shù)堿)，繪制樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4.2 大孔吸附樹(shù)脂吸附透過(guò)曲線

取3支玻璃層析柱(20 mm×400 mm)，各加AB-8樹(shù)脂30 mL(樹(shù)脂干重5.51 g)，樣品溶液上樣，吸附流速2BV/h，每1BV收集一次，逐次標(biāo)記，HPLC測(cè)定流出液中ρ(喜樹(shù)堿)并繪制吸附透過(guò)曲線。

1.2.4.3 pH值對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的吸附性能影響

取AB-8濕樹(shù)脂2.5 g，5份，分別加入pH=4、6、8、10、12的樣品溶液100 mL，靜態(tài)吸附24 h，HPLC測(cè)定ρ(吸附殘液)。

1.2.4.4 ρ(洗脫液)對(duì)樹(shù)脂洗脫性能的影響

取AB-8濕樹(shù)脂2.5 g，5份，靜態(tài)吸附24 h。將樹(shù)脂抽濾洗滌后，置于150 mL三角瓶中，加入φ(乙醇)分別為30、50、70、80、95的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震蕩解析24 h，HPLC測(cè)定ρ(解吸液)。

1.2.4.5 洗脫流速對(duì)樹(shù)脂解吸性能的影響

將樣品溶液700 mL，共3份，以2 BV/h吸附流速通過(guò)裝有30 mLAB-8樹(shù)脂的層析柱，平衡5 h，用3BV蒸餾水洗滌柱床，最后用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫，洗脫流速為1、2、3 BV/h，洗脫體積9BV，HPLC測(cè)定流出液和洗脫液中ρ(喜樹(shù)堿)。

1.2.4.6 樹(shù)脂穩(wěn)定性研究

將AB-8濕樹(shù)脂2.5 g，按1.2.3方法解吸。解吸后，將樹(shù)脂置于150 mL三角瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，磁力攪拌30 min對(duì)樹(shù)脂再生，然后過(guò)濾，蒸餾水洗滌樹(shù)脂，將再生后的樹(shù)脂二次進(jìn)行吸附與解吸，如此重復(fù)操作4次，HPLC測(cè)定各次ρ(吸附殘液)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ρ(樣品液)的測(cè)定

按1.2.1的方法操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由于提取濃縮液是生產(chǎn)過(guò)程中可以直接獲得濃度最高的喜樹(shù)堿水溶液，故此實(shí)驗(yàn)中涉及的樣品溶液ρ(喜樹(shù)堿)，均為0.175 mg/mL。

表1 濃縮液中ρ(喜樹(shù)堿)

2.2 大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附/解吸實(shí)驗(yàn)

按1.2.3方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D402型與AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿有較大的吸附容量；D101型樹(shù)脂次之； X-5與D201型樹(shù)脂吸附量差異不大。

表2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.2.3方法，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 靜態(tài)解析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可見(jiàn)，X-5的解吸率最高，但其吸附能力較差；AB-8和D402具有較高的吸附與解吸能力，均適用于喜樹(shù)堿的分離純化，從成本考慮，優(yōu)選AB-8型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行工藝研究。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂純化喜樹(shù)堿工藝的研究

2.3.1 AB-8樹(shù)脂吸附時(shí)間對(duì)吸附性能的影響

吸附時(shí)間對(duì)吸附性能的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附時(shí)間超過(guò)5 h，吸附量增長(zhǎng)趨于平緩，吸附幾近飽和，所以確定吸附時(shí)間為5 h，吸附效果較好。

2.3.2 pH值對(duì)吸附性能的影響

pH值對(duì)吸附性能的影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 pH值對(duì)樹(shù)脂吸附性能的影響

結(jié)果表明，在pH=4～8，隨著pH值增大，吸附容量也相應(yīng)增加；當(dāng)pH值大于8，吸附量有所下降，推測(cè)是喜樹(shù)堿鈉鹽具有易氧化分解的不穩(wěn)定性引起的，實(shí)驗(yàn)確定pH值對(duì)吸附量的影響并不大，考慮到簡(jiǎn)化工藝步驟，確定不調(diào)pH值上樣。

2.3.3 吸附透過(guò)曲線的繪制

將0.175 mg/mL喜樹(shù)堿樣品溶液，以2 BV/h的吸附流速過(guò)樹(shù)脂柱，HPLC測(cè)定流出液中ρ(喜樹(shù)堿)，以流出液體積為橫坐標(biāo)，ρ(流出液)為縱坐標(biāo)，繪制吸附透過(guò)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

流出液體積/BV圖1 喜樹(shù)堿的吸附透過(guò)曲線

由圖1所示，在吸附流速為2 BV/h的條件下，吸附溶液流經(jīng)前18BV未發(fā)生泄露，從19BV開(kāi)始，隨著流出液體積的增加，泄露率不斷增高，當(dāng)流出液體積超過(guò)23BV，泄露曲線趨向平緩，表明樹(shù)脂吸附已經(jīng)接近飽和，此時(shí)吸附量為20.48 mg/g。

2.3.4 φ(乙醇)對(duì)樹(shù)脂洗脫性能的影響

按1.2.4.4方法，結(jié)果見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)表明，隨著φ(乙醇)的升高，喜樹(shù)堿的洗脫率也不斷提高，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫率最高，而且高φ(乙醇)進(jìn)行洗脫，洗脫液便于濃縮，能夠減少回收水分帶來(lái)的目標(biāo)物損耗，因此選擇φ(乙醇)=95%的乙醇為洗脫溶劑。

表6 φ(乙醇)對(duì)樹(shù)脂洗脫性能的影響

2.3.5 洗脫流速對(duì)樹(shù)脂洗脫性能的影響

按1.2.4.5方法，結(jié)果見(jiàn)表7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著洗脫流速的增大，洗脫率逐漸降低，而且根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，洗脫流速通?？刂圃谖搅魉俚亩种槐容^理想，故選擇洗脫流速為1 BV/h。

表7 洗脫流速對(duì)樹(shù)脂洗脫性能的影響

2.3.6 大孔吸附樹(shù)脂的穩(wěn)定性研究

按1.2.4.6方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新樹(shù)脂和再生后的樹(shù)脂吸附率差別大，再生后的樹(shù)脂之間吸附率差別較小。

表8 樹(shù)脂使用次數(shù)對(duì)吸附率的影響

2.3.7 AB-8樹(shù)脂的最佳純化工藝

取700 mL提取濃縮液通過(guò)裝有30 mL AB-8濕樹(shù)脂的層析柱(20 mm×400 mm)，按上述選定的上樣、洗脫條件操作，每1BV收集一瓶，依次編號(hào),GF254硅膠薄層點(diǎn)樣跟蹤，合并檢出項(xiàng)，HPLC測(cè)定流出液及ρ(洗脫液)，計(jì)算樹(shù)脂的吸附量和洗脫率，洗脫液經(jīng)濃縮去醇，干燥后稱量，計(jì)算洗脫物中喜樹(shù)堿的純度，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 樹(shù)脂最佳工藝條件下動(dòng)態(tài)性能參數(shù)

經(jīng)GF254硅膠薄層點(diǎn)樣跟蹤，1～8號(hào)瓶在紫外光下，喜樹(shù)堿斑點(diǎn)可見(jiàn)，第9號(hào)瓶開(kāi)始無(wú)喜樹(shù)堿檢出，合并1～8號(hào)瓶，HPLC測(cè)定洗脫液中ρ(喜樹(shù)堿)，在選定的上樣、洗脫條件下，φ(乙醇)=95%洗脫8BV，洗脫率可達(dá)83.1%，洗脫物中喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7%，說(shuō)明AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)葉粗提液的凈化效果良好，效率高，工藝可行。

3 結(jié) 論

結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行篩選，優(yōu)選出AB-8大孔吸附樹(shù)脂，并對(duì)樹(shù)脂的上樣、洗脫條件的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行考察，確定AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化喜樹(shù)堿粗提液的最佳工藝為：將濃縮液不調(diào)pH值上樣，上樣流速2 BV/h，平衡吸附5 h；用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇以1 BV/h流速進(jìn)行洗脫，洗脫量為8BV。該條件下洗脫物中喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7%，通過(guò)對(duì)樹(shù)脂再生性能的考察，發(fā)現(xiàn)新樹(shù)脂吸附一次后，吸附率下降約30%，每次使用后需對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行系統(tǒng)地再生。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1] Hiang YH,Herizberg R,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I [J].Biol Chem,1985,260:14873-14878.

[2] 李善吉,伍勝君.大孔樹(shù)脂的應(yīng)用概況[J].廣東輕工技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,4(2):11-13.

[3] 劉彬果,郭文勇,鐘蕾,等.大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)在中藥中的應(yīng)用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(6):452-455.