朱慶麗，王 威，凌 真，錢 斐

(揚州市食品藥品檢驗檢測中心,楊州 225009)

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苯磺貝他斯汀片微生物限度檢查方法的驗證

朱慶麗，王 威，凌 真，錢 斐

(揚州市食品藥品檢驗檢測中心,楊州 225009)

目的：建立苯磺貝他斯汀片的微生物限度檢查法，并對其進行驗證。方法：按2015版《中國藥典》(四部)相關內容，以試驗菌回收率在0.5～2為要求，細菌、霉菌及酵母菌采用常規(guī)平皿法；大腸埃希菌采用常規(guī)法。結果：采用常規(guī)法，白色念珠菌的回收率小于50%，其余試驗菌的回收率均在0.5～2之間。通過增加稀釋液法，可消除供試品對白色念珠菌的抑制作用，其回收率在0.5～2之間；控制菌采用常規(guī)法即可檢出。結論：細菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法，霉菌及酵母菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，控制菌按常規(guī)法，可作為苯磺貝他斯汀片微生物限度檢查方法。

苯磺貝他斯汀片，微生物限度方法適用性試驗，集落計數(shù)，驗證

苯磺貝他斯汀片為口服片劑，是一種常見的抗過敏藥，臨床運用于蕁麻疹、過敏性鼻炎、皮膚疾病引起的瘙癢(濕疹、癢疹、皮膚瘙癢癥)等，使用同時也存在尿量減少、呼吸困難、肢體麻木等不良反應。關于本品，檢驗標準研究還較少，在微生物限度檢查方面鮮有研究。本實驗以試驗菌的回收率為依據(jù)，對該口服片劑的細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)以及控制菌進行驗證，能有效反應該片劑在生產(chǎn)、運輸、存儲過程中的污染情況，有助于提高該制劑的質量控制水平。

1 儀器與試藥

1.1 試驗樣品 苯磺貝他斯汀片(規(guī)格:10 mg，批號20130401、20130402、20130403，江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 實驗儀器及設備 電熱恒溫干燥箱(HKG-9220A型，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，壓力蒸汽滅菌器、生物顯微鏡、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，霉菌培養(yǎng)箱(MJX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，海爾冷柜，水浴振蕩器，電子天平。

1.3 驗證用菌種 銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌 [CMCC(F) 98001]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B) 63501]、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B) 26003]、黑曲霉 [CMCC(F) 98003)]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 驗證用培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(顆粒，批號20150922)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(顆粒，批號20150819)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(顆粒，批號20150923)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號20151105)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(顆粒，批號20150722)、pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號20150108)，均由青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備 選取兩個相同包裝的供試品，從最小包裝單位中量取各5 g(共10 g)的樣品，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，然后用勻漿儀充分混勻，并最終將其制成1∶10的供試液。

2.2 菌液的制備 取經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌第三代培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為不大于100 cfu/ml的菌懸液。取經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h的第二代白色念珠菌，用上述溶液稀釋成不大于100 cfu/ml的菌懸液。取經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d的第三代黑曲霉，加適量含0.05%聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋成不大于100 cfu/ml的孢子懸液。

2.3 培養(yǎng)基的適用性檢查

2.3.1 方法 取稀釋后的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，分別注入到無菌平皿中，并立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻，凝固，放置 30～35 ℃培養(yǎng) 48 h，計數(shù)；取稀釋后的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備 2 個平皿，混勻，凝固，置20～25 ℃培養(yǎng) 72 h，計數(shù)，同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。

2.3.2 結果判定 通過觀察和計數(shù)，被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)相比，明顯大于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的50%，且菌落形態(tài)、大小與對其基本一致，可以判斷培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

2.4 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證 當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應對細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法進行驗證，以確認該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌可以采用該方法進行測定[1]。

2.4.1 試驗組 取 1∶10的供試液和相應的試驗菌懸液各 1 ml至無菌平皿中，然后注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2個平皿，混勻，冷卻，凝固。分別制成含銅綠假單胞菌、白色念珠菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的試驗組，細菌在30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～ 48 h，霉菌及酵母菌在20～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～ 72 h，按平皿法計數(shù)。

2.4.2 菌液組 用刻度吸管分別吸取各菌液 1 ml，加入相應的培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，并且放置在規(guī)定的條件下進行培養(yǎng)，然后計數(shù)所加的試驗菌集落。

2.4.3 供試品對照組 取規(guī)定量供試液，加入相應的培養(yǎng)基，按照菌落計數(shù)方法，測定該供試品的本底菌數(shù)。

2.4.4 回收率的計算 試驗組菌回收率(%)=[(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%

2.4.5 實驗結果 《中國藥典》2015年版四部規(guī)定進行3次獨立的平行試驗，各試驗菌株的回收率的比值應在0.5～2范圍內。試驗結果見表1和表2。

表1 各組菌落計數(shù)

表2 試驗組各菌株回收率

由表2可知：通過3次獨立的平行試驗，試驗組的銅綠假單胞菌的平均回收率為82%，枯草芽孢桿菌的平均回收率為89%，金黃色葡萄球菌的平均回收率為82%，黑曲霉的平均回收率為83%，均高于50%，說明此樣品對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉均無抑菌作用，可以采用平皿法進行細菌數(shù)的測定。而白色念珠菌的試驗組平均回收率為46%，低于50%，說明此樣品對白色念珠菌有一定的抑菌作用，需要采用增加稀釋液法等重新對其菌回收率進行驗證。

根據(jù)《中國藥典》2015版四部微生物計數(shù)法，若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50%，可采用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積等方法消除供試品的抑菌活性[2]。采用增加稀釋液法(制成1∶20供試液)對白色念珠菌重新驗證，結果見表3。由表3可知：通過3次獨立的平行試驗，試驗組的白色念珠菌的回收率均大于50%，所以此樣品可以采用增加稀釋液法來進行霉菌及酵母菌的計數(shù)。

表3 各組白色念珠菌菌落計數(shù)及試驗組回收率

2.5 控制菌檢查方法的驗證 苯磺貝他斯汀片為口服化學藥，不含藥材原粉及動物組織(包括其提取物)，在此主要驗證其大腸埃希菌。

2.5.1 試驗組 取大腸埃希菌的菌懸液 1 ml和1∶10供試品溶液 10 ml，加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，作為試驗組。

2.5.2 陽性對照組 取大腸埃希菌的菌懸液 1 ml，加入到 100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，作為陽性對照組。

2.5.3 陰性對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 10 ml，加入到 100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，作為陰性對照組。

2.5.4 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44 ℃培養(yǎng)24～48 h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18～72 h。若有菌落生長，需分離純化，確證是否為大腸埃希菌。若沒有細菌生長，或雖有細菌生長但鑒定結果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。

2.5.5 驗證結果 試驗組和菌液組麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有菌落生長，經(jīng)確證為大腸埃希菌；供試品對照組麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上無菌落生長，未檢出大腸埃希菌。

2.6 結果 經(jīng)驗證，用常規(guī)平皿法對細菌數(shù)進行測定，采用增加稀釋液法對霉菌及酵母菌進行測定，其回收率均在0.5～2范圍內。按常規(guī)法對大腸埃希菌進行檢查，試驗組檢出陽性對照菌。

3 討論

藥品的微生物檢查結果受到很多因素的影響，例如：樣品中微生物可能分布不均勻、滅菌的徹底程度、培養(yǎng)基的配制、檢驗的條件、培養(yǎng)的條件等等[3]。同時，實驗用的培養(yǎng)基、菌株的保存及菌液的制備應符合《中國藥典》要求[4]，實驗室菌株的保存與處理也是微生物實驗的一個重要環(huán)節(jié)，標準化、規(guī)范化的操作程序可以盡量減少菌種污染和生長特性的改變，以確保不影響實驗結果。工作菌株的傳代次數(shù)應嚴格控制，不得超過五代(從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第零代)，以防止過度的傳代增加菌種變異的風險[5]。再者，操作人員的不熟練對檢驗結果也會造成影響。比如將1 ml供試液加入到不大于100 cfu的菌懸液，此時還沒有注入培養(yǎng)基，而濃度較高的供試液與菌懸液可能不能完全混合，如果該供試品抑菌作用較強，則會影響菌懸液中的活菌計數(shù)。因此，在加入供試液和菌懸液后，應立即將培養(yǎng)基注入，否則可能導致微生物迅速生長或死亡，從而影響試驗結果。因此，在藥品微生物檢驗的過程中，為使檢查結果可靠、可信，必須從所有可能發(fā)生的角度去考慮問題，通過方法學驗證，嚴格按照微生物實驗室規(guī)范指導原則進行試驗。

4 結論

苯磺貝他斯汀片的細菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法進行檢查，霉菌及酵母菌計數(shù)采用增加稀釋液法，控制菌按常規(guī)法驗證。該實驗為本品的微生物限度檢查提供了可靠的依據(jù)。

1 馬仕洪，袁美琴，劉鵬，等.《中國藥典》2010年版對照培養(yǎng)基的研制與應用[J].中國藥事，2012，26(8)：847-851

2 中國藥典[S].四部.2015：140-144

3 李玉芹.淺談目前無菌檢查和微生物限度檢查存在的問題[J].中國藥事，2007，21(12)：1011-1013

4 馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[J].北京：科學出版社，2000：62-82

5 汪穗福.微生物檢測驗證技術[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：104-107

2015-06-21

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