楊壽娟， 張 穎, 劉 寅

(1． 天津醫(yī)科大學研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科， 3. 天津市胸科醫(yī)院CCU科， 天津 300222)

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冠心病患者外周血中miRNA-21的表達水平及其臨床意義*

楊壽娟1， 張 穎2△, 劉 寅3

(1． 天津醫(yī)科大學研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科， 3. 天津市胸科醫(yī)院CCU科， 天津 300222)

目的：探討微小RNA-21(miRNA-21)在冠心病患者及冠狀動脈無病變者血漿中含量的差異及其臨床意義。 方法：采集冠心病患者(試驗組，56例)及冠狀動脈無病變者(對照組，10例)的血漿，根據(jù)診斷指南提及的癥狀、心電圖、心肌酶、造影結(jié)果將冠心病分為心絞痛(39例)和急性心肌梗死(17例)兩個亞組，提取總miRNA，運用熒光實時定量PCR (qRT-PCR)方法檢測miRNA-21含量及分析miRNA-21在各組中的差異表達。測定CK-MB、cTnI、BNP、冠脈Gensini積分、LVEF值、LV、HCY等，并分析miRNA-21與這些臨床指標的相關(guān)性。 結(jié)果：與對照組比較，冠心病患者miRNA-21表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；并且急性心肌梗死組較心絞痛組miRNA-21表達水平明顯升高。AMI組和對照組CK、CK-MB、cTnI、Genisis積分比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相關(guān)分析表明：急性心肌梗死患者循環(huán)miRNA-21的表達量與CK、CK-MB、cTnI呈正相關(guān)性，與BNP、冠脈Gensini積分、LVEF值、LV存在負相關(guān)性。結(jié)論：冠心病患者miRNA-21表達較對照組表達水平升高，急性心肌梗死亞組更為顯著。miRNA-21可能為急性心肌梗死潛在的診斷學標記物，其與冠脈狹窄程度有關(guān)，miRNA-21可能對缺血灌注損傷的心肌具有保護作用。

微小RNA；冠心?。籷RT-PCR；冠脈狹窄；Genisis積分

冠心病是目前世界上發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，嚴重危害人類健康。目前，雖然已有一些與冠心病相關(guān)的生物標志物，但仍然需要進一步尋找新的生物標志物來提供更早、更準確、更敏感的預警，為臨床上對冠心病的早期診斷、治療和預后判斷提供依據(jù)。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中進化保守的內(nèi)源性非編碼單鏈 RNA 小分子[1]，參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控。多項研究表明miRNA參與冠心病發(fā)生、發(fā)展病理過程的調(diào)節(jié)。冠心病的發(fā)生機制如脂質(zhì)代謝改變、血管壁細胞損傷和心肌細胞缺血缺氧等過程都與miRNA相關(guān)[2,3]。miRNA對心肌細胞缺血缺氧有保護作用[4]，其中miRNA-21還對損傷后新生內(nèi)膜增生有促進作用，可在心肌梗死發(fā)生后減少心肌梗死的面積。故而，研究 miRNA-21在急性心肌梗死中表達水平對心?；颊叩脑\斷、預后評估等方面具有重要的意義。Dong等[5]結(jié)扎SD大鼠左冠狀動脈建立急性心肌梗死模型，在心肌梗死后6 h檢測心肌細胞miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)miRNA-21在梗死區(qū)表達明顯降低，而在臨界區(qū)表達顯著提高，并且可以通過缺血預處理阻止這種分布異常。

目前對 miRNA-21的相關(guān)研究主要集中在動物和細胞實驗，臨床研究少見報道。本研究納入較大樣本量，觀察急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者、心絞痛(angina pectoris,AP)患者與冠狀動脈無病變者血漿中 miRNA-21的表達是否存在差異，以明確 miRNA-21的臨床意義，如與急性心梗生物標志物及心衰指標的相關(guān)性，為心肌梗死的防治提供新的思路和治療靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)收集2013年5月至2013年7月來自天津市胸科醫(yī)院曾行冠脈CT或冠脈造影的患者，按照排除標準選擇年齡40～75歲，共66例，男48 例，女18 例。

診斷標準：左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈為主要血管，采用標準Judkins法，每支血管至少3個以上的多體位頭投照，造影證實1支或1支以上血管直徑狹窄>50%，診斷為冠心病。試驗組：冠心病組。對照組：冠脈無病變組，此組患者以心前區(qū)不適入院，經(jīng)冠脈CT或冠脈造影證實為冠狀動脈無明顯狹窄病變。其中對照組10例，冠心病組56例，冠心病組分為2個亞組：心絞痛組39例，急性心肌梗死組17例。

根據(jù)診斷指南將冠心病分為心肌梗死(AMI)組和心絞痛(AP)組。AMI入院標準：參照2010年“急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南”[6]和2012年“非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南”[7]，典型長時間的胸痛，伴有標準12導聯(lián)心電圖連續(xù)變化，或肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)明顯升高(大于正常上限的2倍以上)。AP組：患者近24 h內(nèi)有靜息心絞痛發(fā)生，伴心電圖一過性明顯的缺血性ST-T改變，但無明顯的CK升高(小于2倍正常值上限)，在觀察期間出現(xiàn)ST段抬高或新的Q波者不包括在內(nèi)；典型的勞力性心絞痛，最近6個月內(nèi)有惡化或靜息心絞痛發(fā)作。

按照Gensini積分[8]方法對冠狀動脈病變程度進行定量評價，根據(jù)美國心臟學會所規(guī)定的冠狀動脈血管圖像記錄分段評價標準，對每支血管病變程度進行定量評定，每例患者冠狀動脈病變程度的最終積分為3支主要分支的積分之和。

排除標準：合并有瓣膜性心臟病、急慢性感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、周圍血管性疾病、嚴重肝腎功能不全、全身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等疾病。

1.2 樣品采集及處理

研究對象于空腹狀態(tài)抽取外周靜脈血2 ml，放入EDTA抗凝管，4℃，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于-80℃保存。所有樣本采集和使用均經(jīng)我院倫理委員會同意，并征得患者或患者家屬知情同意。

采集研究對象的一般臨床資料：包括性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、吸煙史、血生化指標、造影結(jié)果等。冠脈造影采用標準Judkins法行左、右冠狀動脈造影。

測定指標：測定研究對象血漿中miRNA表達水平，本研究冠心病組及對照組靜脈血中miRNA相對表達水平比較采用2-△△CT法。miRNA的表達量=2-△CT，其中△CT為△CTmiRNA-21與△CT內(nèi)參cel-39的差值，△△CT為△CT冠心病組與△CT對照組的差值。

1.3 主要試劑

總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒， 熒光探針及外源性cel-miR-39；無水乙醇、無RNA酶純水、7500熒光定量RCR儀；成熟miRNA 序列為UCACCGGGUGUAA AUCAGCUUG，ABI產(chǎn)品的ID為000200，微小RNA-21序列為UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，ABI產(chǎn)品的ID為000397(ABI,美國)。

1.4 qRT-PCR

樣品提取總miRNA，反轉(zhuǎn)錄后按照說明書進行熒光實時PCR(qRT-PCR)反應。qRT-PCR反應條件：95℃ 10 min； 95℃ 15 s，60℃ 60 s；40個循環(huán)，組內(nèi)重復3次取平均值。microRNA表達水平以Ct值表示即每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。本研究冠心病組及對照組血漿中miRNA相對表達水平比較采用2-△△CT法。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象的基本情況

為排除其他因素對miRNA相對表達水平的影響，對AP組、AMI組和對照組的各種因素進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組之間各個影響因素的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of the general data of patients with different clinical types

IndexControlgroup(n=10)APgroup(n=39)AMIgroup(n=17)Male(%)4(40.00)32(82.05)12(70.59)Smokinghistory(%)3(30.00)22(56.41)12(70.59)Drinkinghistory(%)3(30.00)6(35.90)8(47.06)Hypertension(%)4(40.00)25(64.10)11(68.75)Diabetes(%)1(10.00)11(28.21)4(23.53)Familymedicalhistory(%)3(30.00)16(41.03)6(35.29)Age(year)56.20±5.5059.70±8.4062.80±7.80BMI(kg/m)25.25±1.8025.25±2.3024.90±1.78TG(mmol/l)2.31±1.412.12±1.641.85±0.86TC(mmol/l)4.96±1.154.46±1.135.05±1.11HDL(mmol/l)1.18±0.311.11±0.201.16±0.26LDL(mmol/l)2.89±0.892.53±0.933.20±0.91ApoA1(g/l)1.20±0.161.13±0.251.17+0.28ApoB(g/l)1.02±0.280.93±0.261.12±0.29HCY(μmol/L)12.35±4.4815.87±7.3914.22±6.39GLU(mmol/L)5.89±1.056.38±1.937.49±2.08

BMI： Body mass index； TG： Triglyceride； TC： Total cholesterol； HDL： High density lipoprotein； LDL： Low density lipoprotein； ApoA1： Apolipoprotein A1； ApoB： Apolipoprotein B； HCY: Homocysteine； GLU: Fasting blood-glucose

2.2 miRNA-21在冠心病患者中的表達

與對照組相比，心絞痛組miRNA-21表達上調(diào)1.9倍(P<0.05)，而AMI組上調(diào)達3.2倍(P<0.05)，說明miRNA-21在AMI組表達異?；钴S，可作為AMI診斷的參考指標(圖1)。

2.3 miRNA-21在AMI患者ROC曲線

miRNA-21在冠心病患者表達差異有統(tǒng)計學意義，急性心肌梗死患者表達顯著上調(diào)。在急性心肌梗死患者miRNA-21表達水平的敏感度為73.76%，特異度78.47%，研究表明 miRNA-21 可能是急性心肌梗死潛在的診斷學標記物。采用ROC曲線( receiver operating characteristic curve)評價循環(huán)miRNA-21相對表達量與急性心肌梗死的診斷是否有價值。循環(huán) miRNA-21 表達量ROC曲線下面積AUC=0.6885(95%CI 0.6489～0.7282)，與CK、CK-MB、cTnI具有相似的敏感度(圖2)，提示通過循環(huán) miR-21判斷急性心肌梗死與否具有較高準確性的診斷價值。

Fig. 2 Compared miRNA, CK, CK-MB, cTnI in diagnosis sensitivity of acute myocardial infarction(a-d)

2.4 AMI組、AP組和對照組CK、CK-MB、cTnI、Genisis積分的差異miRNA-21的相關(guān)性

CK、CK-MB、cTnI、BNP、冠脈Gensini積分分值、LVEF值、LV在急性心肌梗死組、心絞痛組、對照組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與心肌缺血的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)(表2)。采用Pearson 檢驗進行相關(guān)性分析，急性心肌梗死患者循環(huán)miRNA-21的表達量與CK、CK-MB、cTnI呈正相關(guān)性，與BNP、冠脈Gensini積分分值、LVEF值、LV存在負相關(guān)性，而在心絞痛組及對照組上述指標無明顯相關(guān)性。

Tab. 2 Comparison of factors such as CK, CK-MB, cTnl, Genisis integral etc between AMI group,angina, angina group and the nonmal group

CK: Creatine kinase； CK-MB： Creatine kinase isoenzyme； cTnI: High sensitive troponin I； HCY: Homocysteine； BNP: B type natriuretic peptide urea； LVEF： Left ventricular ejection fraction； LV： Left ventricular end- diastole diameter

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsAP group

3 討論

心肌缺血是導致心肌細胞死亡的直接原因之一，許多研究也證明 miR-21 參與了心肌細胞凋亡及缺血/再灌注損傷。Yin C等[9]發(fā)現(xiàn)用熱休克或預處理誘導miRNA-21表達可明顯減少心肌梗塞面積，提示熱休克蛋白70、內(nèi)皮誘導性一氧化氮合成酶可能參與miRNAs介導的心肌保護機制。Van Rooij E等[10]對心梗病人的心肌組織標本也進行了miRNAs表達檢測，發(fā)現(xiàn)心梗的邊緣區(qū)mir-21明顯上調(diào)，但在梗死區(qū)域內(nèi)miR-21反而降低，與動物試驗的心梗模型中的變化趨勢一致。miRNA-21對缺血灌注損傷的心肌具有保護作用[11]。這一結(jié)果表明miR-21很可能在AMI早期起著相當重要的作用。

miRNA-21 在正常心臟中表達很低，但在各種心衰、心肌肥厚、缺血缺氧等條件下明顯升高[12]，機制不同，如研究證明miR可能是通過負性調(diào)控L -型鈣通道蛋白的表達,降低細胞內(nèi)鈣離子濃度,抑制心肌細胞肥大[13]。本研究證實了這一點，結(jié)果顯示miRNA-21在急性心肌梗死組中表達量較對照組明顯升高。這一研究結(jié)果與Duan X等人[14]的研究結(jié)果可相互印證，即miRNA-21的表達參與控制心肌缺血相關(guān)基因的調(diào)控，其調(diào)控策略復雜且包含多種的信號轉(zhuǎn)導途徑。本實驗相關(guān)性分析可得出急性心肌梗死患者循環(huán)miRNA-21的表達量與心肌梗死診斷標志物CK、CK-MB、cTnI呈正相關(guān)性，與BNP、冠脈Gensini積分分值、LVEF值、LV存在負相關(guān)性。BNP升高、LV 增大、LVEF值降低，提示心功能減低，而實驗所得急性心肌梗死患者血漿中miRNA-21的表達與其成負相關(guān)性。另外，本實驗得出冠脈輕度狹窄患者和冠脈中重度狹窄患者的血漿中miRNA-21與對照組比較有統(tǒng)計學差異，說明miRNA-21與冠脈狹窄程度有關(guān)。這一結(jié)果證明了Kukreja RC等人的推測[4]，即miRNA-21可能參與心肌的缺血/再灌注(I / R)損傷和心臟衰竭的自身保護機制。

綜合本研究的試驗結(jié)果，急性心肌梗死患者中miRNA-21表達水平的敏感度為68.85%，與CK、CK-MB、cTnI診斷急性心肌梗死具有相似的敏感度，據(jù)此可推測 miRNA-21可能作為急性心肌梗死新的和敏感的預測診斷指標，不但為相關(guān)研究提供理論依據(jù)，也為臨床診治提供早期治療的可能性，從而取得更好的預后療效。這一展望與Wang F等人的期望相符[15]，即miRNAs可能是急性心肌梗死新的和強大的生物標志物，可能是AMI的潛在的診斷工具。

若要完美實現(xiàn)這一目標，需要解決miRNA-21的心肌特異性問題。已知miRNA-21為非心肌組織特異性存在的miRNA，其擁有多個靶基因，故其表達容易受到其他非研究因素的影響，如急性心肌梗死患者取血時心梗的時間會影響實驗結(jié)果，實驗組例數(shù)偏少及實驗過程中實驗樣本在降解，可能存在誤差偏移。大部分急性心肌梗死患者同時患有高血壓病、糖尿病，這兩種疾病對循環(huán)miRNA-21有所影響，繼而干擾miRNA-21的檢測結(jié)果。但Liu F等人的研究[16]認為，循環(huán)miRNA-21具有較好的心肌相關(guān)性，其表達和心肌功能和纖維化程度密切相關(guān)，可以作為心室細胞凋亡的敏感標志物。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[17,18]， I/R(缺血/再灌注)組心肌膠原含量和左室舒縮功能明顯降低， 血漿 CK、LDH 活力和心肌基質(zhì)金屬蛋白酶- 2 (MMP- 2) 蛋白表達及 miRNA 水平明顯升高，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑- 2(TIMP- 2) 蛋白明顯降低，而IPTC(缺血后處理)組恰恰相反，其機制可能與抑制心肌中 MMP-2 表達， 促進 TIMP-2 表達有關(guān)。Roy等[19]利用miRNA-21模擬技術(shù)的小鼠實驗有效地抑制PTEN-P13K-Akt-MMP2信號通路中miRNA-21靶基因PTEN的表達，促進Art磷酸化，上調(diào)MMP-2的表達，從而促進缺血/再灌注誘導的成纖維細胞引起心臟重構(gòu)，明顯減少了缺血/再灌注后心肌梗死面積。綜上所述，本研究顯示miRNA可能成為冠心病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以miRNA為藥物治療靶點對缺血心肌進行臨床治療提供新思路。

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Research on expression of miRNA-21 in the peripheral blood of coronary heart disease and its clinical significance

YANG Shou-juan1, ZHANG Ying2△, LIU Yin3

(1. The Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070; 2. The Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital;3. CCU, Tianjin Chest Hospital, Tianjin 300222, China)

Objective: To study the expression difference in MicroRNA -21(miRNA-21)levels of the plasma between the patients with coronary heart disease and the subjects without coronary artery lesions, and its clinical significance. Methods: Plasma was obtained from the patients with coronary heart disease(trial group，56 cases)and the subjects without coronary artery lesions(control group，10 cases), patients with coronary disease were divided into angina(AP, 39 cases) and acute myocardial infarction(AMI, 17 cases)subgroup, the contents of miRNA-21 were detected using qRT-PCR method, and the differential expression of miRNA-21 in each group was analyzed. The levels of creatine kinase isoenzyme(CK-MB), high sensitive troponin I(cTnI), B type natriuretic peptide urea(BNP), Gensini, left ventricular ejection fraction(LVEF), integral value of coronary left ventricular end diastole diameter(LV) and homocysteine(HCY) were determined and the correlation between miRNA-21 and these clinical indexes was analyzed. Results: Compared with control group, there was a significant difference in expression of miRNA-21 in patients with angina and AMI(P<0.05),and miRNA-21 expression in AMI group was much higher than that in AP group. There was statistical significance in CK,CK-MB, cTnI,Genisis integral comparison between AMI group and control group (P<0.05).The correlation analysis showed that there was a positive correlation between expression of CK, CK-MB, cTnI and the level of circulating miRNA-21 in patients with acute myocardial infarction. And there was a negative correlation between BNP, Gensini integral, LVEF value of coronary artery, LV and circulating miRNA-21. Conclusion: miRNA-21 was significantly elevated in acute myocardial infarction subgroup than the control group. The level of miRNA-21 associates with the degree of coronary artery stenosis, and might be a potential marker for the diagnosis of acute myocardial infarction. miRNA-21 may play an important role in protecting myocardium from ischemia/reperfusion injury.

miRNA-21; coronary heart disease; real-time fluorescence quantitative PCR; coronary artery stenosis; Genisis integral/score

天津市衛(wèi)生局科技基金項目(2012KZ056)

2014-11-13 【修回日期】2015-01-26

R541/R543

A

1000-6834(2015)02-127-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.009

△【通訊作者】Tel： 13299905349； E-mail： zy89769402@163.com