李俠 王文革 陳方圓

增齡對(duì)兔心房及肺靜脈肌袖組織縫隙連接蛋白的影響

李俠 王文革 陳方圓

目的通過研究家兔心房及肺靜脈肌袖連接蛋白的增齡性改變，探討增齡與房顫的關(guān)系。方法以家兔為研究對(duì)象，分離不同年齡組家兔心房及肺靜脈肌袖組織，用免疫組化的方法檢測心房及肺靜脈肌袖連接蛋白Cx43和Cx40的表達(dá)。結(jié)果隨著年齡增加，心房及肺靜脈肌袖組織Cx43的表達(dá)量呈明顯的下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論兔心房及肺靜脈肌袖連接蛋白存在增齡性改變，可導(dǎo)致房顫的發(fā)生。

增齡；肺靜脈肌袖；連接蛋白；心房顫動(dòng)

心房顫動(dòng)（房顫）是一種年齡相關(guān)性心律失常，發(fā)病率隨年齡的增長而顯著增加，50～59歲組人群中房顫的患病率＜1%，而80～84歲組上升至10%，＞85歲人群為11%～18%［1?2］。隨著年齡的增加，心臟的大體結(jié)構(gòu)及傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生著相應(yīng)的變化，心肌組織本身存在著增齡性結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)［3］。心房組織特別是其一些特殊結(jié)構(gòu)是否也存在增齡性變化？這些變化有什么規(guī)律？有關(guān)這些方面的研究，可能對(duì)增齡相關(guān)的以房顫為主的房性心律失常的發(fā)病機(jī)制的揭示有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以家兔為研究對(duì)象，分離不同年齡組家兔心房及肺靜脈肌袖組織，檢測縫隙連接蛋白（connexin，Cx）的表達(dá)，探討增齡與房顫的關(guān)系，為增齡是否是房顫發(fā)生的主要或獨(dú)立危險(xiǎn)因素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組 健康家兔按月齡分為幼齡組（5～10 d）、中齡組（4～6月）、老齡組（30～34月），每組各6只［4］。幼齡、中齡兔購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，老齡兔購于陜西省閆良種兔場。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 家兔開胸，分離肺靜脈及左右心房組織。把取得的肺靜脈及左右心房組織塊分別放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋制備石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，室溫3%H2O2處理5 min，以滅活內(nèi)源性酶，微波修復(fù)抗原，滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗，每只家兔取2張心肌切片適當(dāng)?shù)渭?∶400稀釋的Cx40多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），另2張切片滴加1∶350稀釋的Cx43抗體（武漢博士德試劑公司），置于冰箱中4℃過夜。PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃1 h，PBS緩沖液清洗2 min×3次。滴加鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin complex，SABC）試劑，37℃20 min，PBS清洗5 min×4次。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。每2張切片中的1張?jiān)俳?jīng)蘇木素輕度復(fù)染，用于觀察Cx40及Cx43的分布。光鏡下Cx40、Cx43陽性著色均表現(xiàn)為棕黃色顆粒。

1.3 圖像分析 每張組織切片上采用OLYMPUS倒置顯微成像系統(tǒng)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野拍攝5幅照片。用Image?Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)所采集的圖象進(jìn)行分析。免疫組化切片測定每個(gè)視野下陽性物質(zhì)的累積光密度（integrated optical density，IOD），對(duì)家兔Cx40、Cx43的光密度參數(shù)進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx± s）表示，用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。3組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，若3組之間差異有顯著性，則進(jìn)行兩兩比較，兩兩比較用LSD?t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨著增齡，左、右心房和肺靜脈肌袖組織Cx43的表達(dá)量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢（P＜0.05）。見表1。在左、右心房組織內(nèi)Cx40表達(dá)量隨著增齡有明顯減少的趨勢（P＜0.05），但肺靜脈肌袖組織內(nèi)Cx40表達(dá)很弱，變化不明顯，各年齡組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。各組家兔Cx43、Cx40免疫組化染色如圖1～6（封二）所示。

表1 3組家兔心房和肺靜脈肌袖Cx43 IOD比較（ˉx±s，n＝6）

表2 3組家兔心房和肺靜脈肌袖Cx40 IOD比較（ˉx±s，n＝6）

3 討論

心肌細(xì)胞間連接處的閏盤中有特化組織，稱之為縫隙連接（gap junction，GJ），GJ允許動(dòng)作電位從一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)布到鄰近的另一個(gè)細(xì)胞，是含有多種細(xì)胞間通道的特殊膜結(jié)構(gòu)，由Cx所構(gòu)成，研究提示Cx的變化可能與一些心律失常有關(guān)［5?6］。心房的GJ主要存在于閏盤，是心肌細(xì)胞端?端連接的特有結(jié)構(gòu)［7］。研究證實(shí)肺靜脈肌袖是人類心臟正常結(jié)構(gòu)的一部分，心肌袖內(nèi)同樣也有Cx表達(dá)［8］。

家兔左、右心房肌均有Cx43和Cx40的表達(dá)，同年齡組左、右房Cx43表達(dá)量多于Cx40，說明Cx43是心房主要的連接蛋白。肺靜脈肌袖主要表達(dá)Cx43，說明Cx43是肺靜脈肌袖主要的連接蛋白；而為何肺靜脈肌袖Cx40的表達(dá)極差。既然肺靜脈肌袖組織在解剖上是心房肌的延續(xù)，而為何在表達(dá)Cx方面存在差異呢？這可能正是局灶性房顫起源于肺靜脈的機(jī)制之一，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，心房及肺靜脈心肌細(xì)胞中Cx43和Cx40的表達(dá)逐漸減少。增齡引起肺靜脈肌袖細(xì)胞Cx表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞間電耦聯(lián)性的進(jìn)一步下降，改變了心肌的電傳導(dǎo)性，使傳導(dǎo)速度減慢或發(fā)生傳導(dǎo)阻滯的程度加重，易于形成折返［9?10］。由于折返的波長等于傳導(dǎo)速度與不應(yīng)期的乘積，增齡引起的Cx重構(gòu)使傳導(dǎo)速度減慢，從而進(jìn)一步使折返的波長縮短，易于在緩慢傳導(dǎo)區(qū)內(nèi)形成多個(gè)微小折返子波。Cx表達(dá)水平越低，相鄰心肌之間的這種傳導(dǎo)性能的差異可能越明顯，這樣就容易形成引起房顫的折返環(huán)路。研究表明，房性心律失常都需要解剖基礎(chǔ)上的沖動(dòng)不連續(xù)傳導(dǎo)，其范圍決定心律失常的類型，這種解剖基礎(chǔ)就是Cx表達(dá)量和分布上的增齡性變化［11?12］。心房內(nèi)或者肺靜脈內(nèi)都可以同時(shí)存在多個(gè)小的折返環(huán)，也可以存在少數(shù)幾個(gè)大的折返環(huán)，當(dāng)折返環(huán)范圍小到一定程度時(shí)，單個(gè)大折返環(huán)在一定程度上變得不穩(wěn)定，或者分裂成數(shù)個(gè)小折返環(huán)，折返環(huán)進(jìn)一步減小并彌散時(shí)，即可導(dǎo)致細(xì)顫。

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Effect of aging on connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit

LI Xia．Department of VIP Internal Medi?cine；WANG Wen?ge．Department of Nephrology，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China；CHEN Fang?yuan．Department of Cardiovascular Medicine，F(xiàn)ist Affiliated Hospital of Medical College，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectiveTo investigate the relationship between aging and atrial fibrillation by studying the age?related changes of the expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit.MethodsEighteen healthy rabbits were divided into three groups by age，the chests of the rabbits were opened and the pulmonary vein sleeve were dislodged. The expression of Cx43 and Cx40 were detected by immunohistochemical staining.ResultsThe expression of Cx43 of pulmonary vein sleeve and atrium was statistically decreased with the aging（P＜0.05）.ConclusionsThe expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium presents with age?related changes，which may lead to atrial fibrillation.

aging；pulmonary vein sleeves；connexin；atrial fibrillation

R 541.75

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.01.008

2014?03?24）

730030甘肅省蘭州市，蘭州大學(xué)第二醫(yī)院VIP內(nèi)科（李俠）；腎病內(nèi)科（王文革）；710061陜西省西安市，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科（陳方圓）