易東 孫榮 魏盟 談世進(jìn)

·論 著·

睪酮對自發(fā)性高血壓大鼠動脈功能和結(jié)構(gòu)的影響

易東 孫榮 魏盟 談世進(jìn)

目的研究睪酮對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）血管功能和結(jié)構(gòu)的影響。

方法將各18只10周齡的SHR及WKY大鼠（Wistar?Kyoto rats）進(jìn)行卵巢切除，并隨機(jī)分為卵巢切除組（ovariec?tomized，OVX），卵巢切除后雌激素補(bǔ)充組（OVX＋EB組）和卵巢切除后雄激素補(bǔ)充組（OVX＋TP組），給予相應(yīng)的激素干預(yù)8周。8周末，處死大鼠，HE染色觀察胸主動脈病理改變。DMT微血管張力測定儀檢測腸系膜動脈乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）和硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）對苯腎上腺素（phenylephrine，PE）誘導(dǎo)的血管舒張作用。

結(jié)果補(bǔ)充雌激素能顯著改善卵巢切除的WKY和SHR大鼠腸系膜動脈對Ach誘導(dǎo)的血管舒張，與SHR＋OVX組相比，SHR＋OVX＋TP組大鼠腸系膜動脈對Ach誘導(dǎo)的血管舒張作用明顯減弱，而WKY＋OVX＋TP組和WKY＋OVX組間的差別則相對較小。各組大鼠對SNP的反應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明睪酮可以減弱WKY和SHR大鼠內(nèi)皮依賴性舒張，且以對SHR的影響更顯著。睪酮干預(yù)可以促進(jìn)SHR平滑肌增生肥大。結(jié)論生理劑量的睪酮可以引起SHR大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮功能紊亂，誘導(dǎo)SHR大鼠平滑肌增生肥大，睪酮引起的血壓升高可能是其機(jī)制之一。

雄激素；雄激素受體；動脈；功能；結(jié)構(gòu)

近年來，心血管疾病呈現(xiàn)持續(xù)高發(fā)狀態(tài)，且有上升趨勢，嚴(yán)重影響人們的身心健康和生活質(zhì)量［1］。研究發(fā)現(xiàn)，盡管目前各國心血管疾病的發(fā)病率差異較大，但女性的心血管疾病的發(fā)生率較年齡相仿的男性高，且絕經(jīng)后女性發(fā)病率明顯升高［2］。提示性別是心血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，性激素在心血管疾病中有重要作用。

既往心血管疾病的性別差異的研究主要集中于雌激素的作用，大部分研究認(rèn)為雌激素對心血管系統(tǒng)起保護(hù)作用［3］。在普通、老年、高鹽飲食等多種大鼠模型的研究中均發(fā)現(xiàn)了血管結(jié)構(gòu)和功能損傷的性別差異，并對其機(jī)制進(jìn)行了廣泛而深入的探索［2?4］，雌激素可以和雌激素受體相結(jié)合，激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS），促進(jìn)一氧化氮（NO）合成和釋放，舒張血管，抑制脂質(zhì)過氧化，降低氧化應(yīng)激，抑制血管間質(zhì)纖維化，減少血管硬化，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。而雄激素對心血管作用的相關(guān)研究則相對較少且多有爭議，本研究通過對卵巢切除自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）補(bǔ)充生理劑量的睪酮，以觀察雄激素對SHR動脈功能和結(jié)構(gòu)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10周齡的無特定病原體級（SPF級）SHR及WKY大鼠各18只，體質(zhì)量（120±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑 丙酸睪酮（中國藥品生物制品檢定所），苯甲酸雌二醇（中國藥品生物制品檢定所），睪酮、雌二醇、孕酮均由碧云天生物研究所提供。

1.3 主要儀器 電子天平，高速低溫離心機(jī)，切片機(jī)（德國SLEE公司型號CUT5062），顯微鏡，酶標(biāo)儀（美國BioTek公司型號ELx800），離體微血管張力測定系統(tǒng)（丹麥DMT公司，型號DMT 620M）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c分組：將各18只SHR及WKY大鼠隨機(jī)分為3個亞組：卵巢切除組（ovariectomy，OVX）、卵巢切除后雌激素補(bǔ)充組（OVX＋EB）及雄激素補(bǔ)充組（OVX＋TP），每組6只，其中OVX組作為陰性對照，OVX＋EB作為陽性對照。為區(qū)分WKY及SHR大鼠，各組名稱分別記為：WKY＋OVX組；WKY＋OVX＋EB組；WKY＋OVX＋TP組；SHR＋OVX組；SHR＋OVX＋EB組；SHR＋OVX＋TP組。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行卵巢切除［5］，并開始藥物干預(yù)。

1.4.2 動物飼養(yǎng)與給藥：所有大鼠均給以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲水，OVX＋EB組給予苯甲酸雌二醇0.25 mg／（kg·2d）肌肉注射，OVX＋TP組給予丙酸睪酮3 mg／（kg·2d）肌肉注射［6］。OVX組給予肌肉注射相同體積的注射用茶油，均持續(xù)8周。8周末測定大鼠血清性激素水平，均對應(yīng)地升高。測定尾動脈收縮壓，結(jié)果顯示補(bǔ)充雌激素的SHR和WKY大鼠動脈壓較OVX組明顯降低；而補(bǔ)充雄激素的SHR和WKY大鼠動脈壓較OVX組明顯升高［7］。

1.4.3 大鼠腸系膜動脈對乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）和硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）的反應(yīng)性測定：處死大鼠后，分離、固定腸系膜動脈，采用DMT血管肌力測定儀檢測血管功能。用含有60 nmol／L的氯化鉀的PSS溶液激活，直至相鄰2次血管收縮峰值相差＜20%。然后用累計(jì)濃度為10－9～10－5mol／L的苯腎上腺素（polyethylene，PE）收縮血管，直至血管最大收縮峰值達(dá)到高鉀收縮峰值的80%～120%，再用累計(jì)濃度為10－9～10－5mol／L的Ach舒張血管。然后，用加熱的PSS液清洗直至血管張力恢復(fù)基線，再次用PE收縮血管，再用累計(jì)濃度為10－10～10－6mol／L的SNP舒張血管；大鼠腸系膜動脈的反應(yīng)性用該血管活性物質(zhì)某一濃度下的肌張力值／PE預(yù)收縮的最大值，動脈對藥物的最大舒張值記作Dmax，血管達(dá)到最大舒張值50%時的藥物濃度記作EC50，DMT血管肌力測定儀自帶軟件分析系統(tǒng)可以自動進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算pD2＝－Log EC50，該值與血管對藥物活性物質(zhì)的反應(yīng)性成正比。

1.4.4 大鼠主動脈結(jié)構(gòu)改變的觀測：處死大鼠，收集血樣后，留取胸主動脈標(biāo)本，分離周圍結(jié)締組織，10%中性福爾馬林溶液固定。石蠟包埋，普通切片機(jī)切成10μm的薄片，HE染色，顯微鏡高倍鏡下觀察彈力纖維的改變及膠原纖維的增生情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有計(jì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。WKY和SHR不同處理間的均數(shù)比較采用雙因素方差分析（two?way ANOVA），滿足方差齊性的多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性的兩兩比較采用近似t檢驗(yàn)。不同品種大鼠同一處理間的比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸系膜動脈對Ach和SNP誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)比較 從圖表中大鼠腸系膜動脈對Ach的反應(yīng)性曲線趨勢、Dmax和pD2來看，SHR各亞組大鼠腸系膜動脈對Ach誘導(dǎo)的血管舒張均比對應(yīng)WKY組明顯減弱（P＜0.05）。補(bǔ)充雌激素能顯著改善卵巢切除SHR和WKY大鼠腸系膜動脈對Ach誘導(dǎo)的血管舒張作用（P＜0.05或P＜0.01）。與SHR＋OVX組相比，SHR＋OVX＋TP組大鼠腸系膜動脈對Ach誘導(dǎo)的血管舒張明顯減弱，而WKY＋OVX組和WKY＋OVX＋TP組間的差別則相對較小。各組大鼠對SNP的反應(yīng)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明睪酮可以減弱WKY和SHR大鼠內(nèi)皮依賴性舒張，且以對SHR的影響更顯著。見圖1和表1。

圖1 各組大鼠腸系膜動脈對Ach（圖A）和SNP（圖B）誘導(dǎo)的血管舒張

表1 各組大鼠腸系膜動脈對Ach和SNP誘導(dǎo)的血管舒張相關(guān)參數(shù)比較（ˉx±s）

2.2 各組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)改變 為檢測睪酮對大鼠SHR血管結(jié)構(gòu)的影響，取大鼠胸主動脈進(jìn)行石蠟切片并HE染色，顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2（封二）所示。圖中能清晰地顯示主動脈的平滑肌肌層，部分切片可以顯示內(nèi)皮層。大體看SHR組動脈平滑肌層厚度較對應(yīng)WKY大鼠輕度增厚。和對應(yīng)的OVX組相比，睪酮干預(yù)對平滑肌基層的厚度無明顯影響，但可見肌束明顯致密、肥厚、走行稍顯紊亂，肌層染色加深，但無明顯離斷，尚無明顯間質(zhì)增生。睪酮干預(yù)組大鼠動脈結(jié)構(gòu)變化以SHR組更為明顯。而雌激素補(bǔ)充組則與睪酮干預(yù)組相反，肌束完整，走行整齊，染色較淡。可見，睪酮可以干預(yù)并輕度促進(jìn)SHR平滑肌增生肥大，但尚無明顯病理損傷改變。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)睪酮可以引起SHR動脈不同程度的功能和結(jié)構(gòu)損傷，與既往多種大鼠模型的研究均發(fā)現(xiàn)睪酮引起動脈結(jié)構(gòu)和功能損傷相一致［4，8］。補(bǔ)充睪酮能顯著升高SHR及WKY大鼠血壓［7］，可能是雄激素促進(jìn)腎臟和動脈功能和結(jié)構(gòu)損傷的機(jī)制之一。

近年來雄激素替代治療（androgen replacement therapy，ART）越來越廣泛地被應(yīng)用于臨床，如先天性性腺發(fā)育不良、慢性腎功不全引起的貧血、急性冠脈綜合征以及老年人性功能不全［9?10］。然而，由于補(bǔ)充雄激素有誘發(fā)或加重老年男性前列腺肥大或前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［9］，ART廣泛用于老年男性受到了制約。近年來ART越來越多地用于女性上述疾病的治療，其安全性引起了人們的關(guān)注。我們的研究采用了雌性大鼠，同時因?yàn)?8周齡的大鼠已經(jīng)開始進(jìn)入絕經(jīng)期，其激素水平波動較大，本研究統(tǒng)一采取卵巢切除然后補(bǔ)充對應(yīng)的激素，以保證基礎(chǔ)激素水平的一致性，本研究各組大鼠最終的激素水平和既往的研究相接近［6，11?12］。

離體微血管功能檢測的廣泛應(yīng)用提高了血管功能檢測的敏感性和可行性，但國內(nèi)尚未大范圍應(yīng)用。本文采用大鼠腸系膜二級動脈，測定動脈對Ach和SNP的反應(yīng)性，由于Ach可以直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，誘導(dǎo)血管舒張，而SNP則直接分解釋放NO，故其可以用于檢測睪酮對大鼠動脈功能有無影響及是否為內(nèi)皮依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)睪酮可以減弱Ach誘導(dǎo)的血管舒張，但對SNP誘導(dǎo)的血管舒張無顯著改變，表明睪酮抑制血管舒張，且這一作用呈內(nèi)皮依賴性，這與近年的研究結(jié)果相一致［13］，但是也有大量研究表明雄激素可以促進(jìn)血管舒張［11?12］，可能與選定的實(shí)驗(yàn)對象不同有關(guān)。本研究采用的劑量對雌性大鼠可能是超生理劑量的。雄激素對大鼠動脈功能影響的具體機(jī)制較為復(fù)雜，本研究未作進(jìn)一步深入探討。既往的研究表明其作用可能與血流動力學(xué)的影響、eNOS?NO系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激的調(diào)控有關(guān)。

既往的研究表明雄激素對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡有廣泛的影響。雄激素可以與其受體結(jié)合，時間和劑量依賴性地上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)，增加細(xì)胞數(shù)和DNA的合成，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖［14］。雄激素還可以通過激活絲裂原激活蛋白激酶途徑，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂［15］。而本研究的結(jié)果也表明睪酮可以促進(jìn)SHR平滑肌增生肥大。

本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充睪酮可以促進(jìn)SHR大鼠SBP升高，既往大量的研究都支持這一結(jié)論［16?18］。雄激素引起血壓升高可能是引起血管內(nèi)皮功能紊亂和平滑肌增生肥大的機(jī)制之一，雄激素可能通過上述多種機(jī)制影響血流動力學(xué)、內(nèi)皮eNOS?NO系統(tǒng)以及平滑肌的增殖，但是本研究并不能確定其因果關(guān)系。

總之，生理劑量的睪酮可以導(dǎo)致SHR大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮功能紊亂，誘導(dǎo)SHR大鼠平滑肌增生肥大，同時睪酮干預(yù)伴隨著血壓的升高，動脈SBP的升高是其可能的機(jī)制之一，但雄激素引起SHR大鼠腎臟和動脈功能和結(jié)構(gòu)改變的確切機(jī)制還有待更深入的研究。

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Effect of testosterone on artery function and structure in spontaneously hypertensive rats

YI Dong，SUN Rong，TAN Shi?jin．．
Department of Geriatrics；WEI Meng．Department of cardiology，Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital，Shanghai 200233，China

ObjectiveTo investigate the effect of testosterone on artery function and structure in spontaneously hy?pertensive rats（SHR）.MethodsEighteen SHR and 18 Wistar?Kyoto rats（WKY）of 10 weeks old were ovariectomized and assigned to three groups randomly：ovariectomized（OVX）group，estrogen supplement after ovariectomy（OVX＋EB）group and androgen supplement after ovariectomy（OVX＋TP）group.The rats accepted intramuscular injection of tea oil 0.5 m l／（kg·2d），estradiol benzoate（EB）0.25 mg／（kg·2d）and testosterone propionate（TP）3 mg／（kg·2d）respec?tively for 8 weeks.At last，all the rats were killed，blood and tissue samples were collected，and HE staining in artery was performed to observe pathological changes.The relaxation response of rats mesenteric artery preconstricted by phenylephrine（phenylephrine，PE）to acetylcholine（Ach）or sodium nitroprusside（SNP）were test with the help of DMT.ResultsEstrogen replacement therapy can significantly improve Ach?induced vasodilation in ovariectomized WKY and SHR.Com?pared with SHR＋OVX，the mesenteric artery vasodilation induced by Ach in SHR＋OVX＋TP group were much weaker，while the difference between WKY＋OVX＋TP and WKY＋OVX was relatively smaller.The difference of rat mesenteric arter?ies response to sodium nitroprusside was not statistically significant.These results indicate that testosterone may weaken en?dothelium?dependent relaxation of WKY and SHR rats，especially for SHR.Testosterone can promote smooth muscle hyper?trophy of aorta in SHR＋OVX＋TP mildly，but there were no significant pathological changes.ConclusionsPhysiological dose of testosterone can lead to mesenteric artery endothelial dysfunction and induce hypertrophy of smooth muscle in SHR rats.Elevated blood pressure is one of the possible mechanisms.

androgen；androgen receptor；artery；function；structure

R 544.1；R 977.12

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.01.006

2014?04?03）

上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉課題（YG2010MS35）

200233上海市，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院老年病科（易東，孫榮，談世進(jìn)）；心內(nèi)科（魏盟）

談世進(jìn)，Email：tanshijinsh＠163.com