胡剛 湛匯

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·論 著·(胃腸道腫瘤專題)

反義miR-224在結(jié)腸癌組織中的表達及其對癌細胞增殖的影響

胡剛 湛匯

目的 探討微小RNA(miRNA)miR-224在結(jié)腸癌組織中的表達，以及對體外癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 收集2011年2月至2014年3月行手術(shù)治療的134例結(jié)腸癌和癌旁組織標(biāo)本，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測標(biāo)本中miR-224表達情況；對人結(jié)腸癌細胞SW480進行miR-224反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)，利用克隆形成實驗和流式細胞儀檢測miR-224反義寡核苷酸對SW480細胞增殖和凋亡的影響，利用Real-time PCR和Western blot法對不同轉(zhuǎn)染組細胞中Bcl-2表達情況進行檢測。結(jié)果 miR-224在結(jié)腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)；反義miR-224組人結(jié)腸癌SW480細胞克隆形成率顯著低于對照組，而細胞凋亡指數(shù)則高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；反義miR-224組細胞Bcl-2相對表達量和蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 miR-224在結(jié)腸癌組織中呈高表達，減少miR-224表達可抑制結(jié)腸癌細胞增殖，并加速細胞凋亡，有可能成為結(jié)腸癌早期發(fā)現(xiàn)及基因治療的新靶位。

結(jié)腸癌；微小RNA-224；反義寡核苷酸技術(shù)；表達；細胞增殖

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來該病發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，韓雪等[1]研究顯示，上海市楊浦區(qū)常住居民結(jié)腸癌的粗發(fā)病率和粗死亡率分別從2002的25.52/10萬和15.41/10萬，上升到2012年的31.76/10萬和26.17/10萬。該病早期不具有典型的臨床癥狀，常會導(dǎo)致漏診或誤診，一旦發(fā)現(xiàn)已進展為中晚期，增加了治療難度，因此，如何從分子或基因水平尋找敏感指標(biāo)以早期發(fā)現(xiàn)和診斷已成為研究重點。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于細胞內(nèi)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在腫瘤發(fā)生、進展過程中發(fā)揮重要作用，而近年來的研究報道亦指出[2-4]，miR-155、miR-21、miR-17等微小RNA在結(jié)腸癌發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。有研究顯示[5]，miR-224在胃癌、肝癌等惡性腫瘤中過表達，與腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲力密切相關(guān)。本研究對結(jié)腸癌組織中miR-224表達情況進行分析，并利用反義寡核苷酸技術(shù)通過抑制miR-224在結(jié)腸癌中的表達，探討其對細胞增殖及凋亡的影響。

材料與方法

一、一般資料

收集2011年2月至2014年3月在我院擇期行手術(shù)治療的134例結(jié)腸癌和癌旁組織標(biāo)本，所有病人術(shù)前均未進行放化療治療，均經(jīng)病理學(xué)確診，其中，男性73例，女性61例，年齡(43.5±7.4)歲。

二、方法

1.實驗細胞及主要試劑和設(shè)備 人結(jié)腸癌細胞株SW480購自上海瑞齊生物科技，TRIzol試劑盒購自美國Sigma公司，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基均購自武漢博士德生物，脂質(zhì)體LipfectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，反義miR-224寡核苷酸購自上海藍基生物科技，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司，TaqMan pri-miRNA試劑盒購自美國ABI公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)儀購自美國Stratagene公司，Epics Altra型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，總蛋白提取試劑盒購自上海純優(yōu)生物科技，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購自上海信裕生物科技。

2.Real-time PCR檢測標(biāo)本中miR-224表達 利用TRIzol試劑盒對結(jié)腸癌及癌旁組織中RNA進行提取，利用紫外分光光度計對其濃度進行測定。將提取的總RNA置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。? μg總RNA作為反應(yīng)模板，取3 μl逆轉(zhuǎn)錄酶進行混合，稀釋至20 μl作為反應(yīng)體系，依次進行16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min反應(yīng)，結(jié)束后，對cDNA進行收集，按照1∶150稀釋后，取稀釋液1 μl與TaqMan引物2 μl進行混合，稀釋至20 μl作為反應(yīng)體系，依次進行95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、59 ℃ 60 s，40個循環(huán)反應(yīng)，以U6 snRNA作為參照，采用Ct值對miRNA相對表達進行精確計算。

3.反義miR-224寡核苷酸序列設(shè)計 根據(jù)MiRBase數(shù)據(jù)庫中提供的基因序列獲得人miR-224序列，并在miR-224序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計完成反義miR-224寡核苷酸相應(yīng)序列：順義鏈5’-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3’，反義鏈5’-TAAACGGAACCACTAGTGACT-3’，并進行同源序列排除，同時設(shè)計對照序列，順義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAT-3’，均由上海藍基生物科技完成。

4.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人結(jié)腸癌細胞株SW480接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件下。參照LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，反義miR-224寡核苷酸終濃度分別選取50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L和200 nmol/L，篩選出100 nmol/L為最佳干擾濃度，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間最終確定為48 h。重復(fù)進行實驗3次。

5.克隆形成實驗測定轉(zhuǎn)染細胞增殖情況 取結(jié)腸癌SW480細胞轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，利用3%胰蛋白酶進行消化后，將細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔600～700個細胞，于37℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)14～21周，對細胞生長情況進行觀察。當(dāng)培養(yǎng)皿中觀察到克隆細胞團時，停止培養(yǎng)。將上清液移除，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行漂洗2次。用甲醇進行固定20 min，將固定液去除后用吉姆薩染液染色30 min，利用重蒸水進行清洗。干燥后于顯微鏡下計數(shù)>50個細胞克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，重復(fù)進行3次實驗。

6.流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 將結(jié)腸癌SW480細胞接種在6孔板上，轉(zhuǎn)染反義miR-224寡核苷酸后48 h，將細胞收集并制備成單細胞懸液，利用PBS進行漂洗2次后，進行3 000 r/min離心5 min，棄上清液，利用凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀對細胞早期凋亡進行檢測，重復(fù)進行實驗3次。

7.Real-time PCR對細胞中Bcl-2 mRNA表達情況檢測 將不同轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)的細胞分別加入細胞裂解液中，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，Bcl-2引物：上游5’-AACTGGGGGAGGATTGTGGC-3’，下游5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’，內(nèi)參照采用GAPDH，Real-time PCR檢測細胞中Bcl-2 mRNA表達。

8.Western blot法對細胞中Bcl-2蛋白表達情況檢測 將不同轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)的細胞分別進行收集，利用總蛋白提取試劑盒進行總蛋白提取，經(jīng)SDS-PAGE后進行轉(zhuǎn)膜，將膜放置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中進行封閉120 min，溫度設(shè)置37 ℃。將鼠抗人Bcl-2單克隆抗體按1∶500稀釋后加入，4 ℃條件下過夜孵育。用TBST緩沖液進行洗膜后，將1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG加入，于37℃條件下進行孵育120 min，用BST緩沖液進行洗膜，以β-actin為內(nèi)參，利用電化學(xué)發(fā)光法對蛋白條帶進行分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、miR-224基因表達與臨床特點相關(guān)性

Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-224基因在結(jié)腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的相對表達量顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 miR-224在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達情況±s)

二、miR-224表達對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖及凋亡的影響

反義miR-224組人結(jié)腸癌SW480細胞克隆形成率為6.37±1.24，顯著低于對照組的29.74±7.65，而細胞凋亡指數(shù)(17.05±1.62)則高于對照組(4.27±1.15)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值為35.232和71.757，均P<0.05)，詳見圖1和圖2。

三、miR-224表達對細胞內(nèi)Bcl-2表達的影響

反義miR-224組細胞Bcl-2 mRNA相對表達量(1.97±0.54)和蛋白相對表達量(0.27±0.06)均低于對照組(5.03±1.04和0.91±0.11)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3和圖4。

圖1 人結(jié)腸癌SW480細胞增殖(A)及凋亡(B)情況

圖2 轉(zhuǎn)染后人結(jié)腸癌SW480細胞生長變化情況

圖3 人結(jié)腸癌SW480細胞中Bcl?2mRNA相對表達量

圖4 人結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Bcl?2表達情況

討 論

miRNA是長度22nt左右的單鏈小RNA分子，在細胞增殖、凋亡及組織發(fā)育方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。有研究指出[7]，miRNA異常表達與多個系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生及進展有關(guān)。miRNA通過調(diào)控與腫瘤形成相關(guān)的基因和傳導(dǎo)通路而對腫瘤發(fā)生及進展產(chǎn)生作用，因此，可能成為腫瘤診斷及判斷預(yù)后的新標(biāo)志物。鑒于miRNA對靶基因的表達調(diào)控可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，這為早期發(fā)現(xiàn)及診斷腫瘤提供了可能，臨床應(yīng)用前景廣闊[8]。

結(jié)腸癌已位居我國腫瘤發(fā)病譜第四位[9]。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，miRNA在腫瘤調(diào)控中的生物學(xué)作用逐漸被人們所熟知，鑒于其在多個系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生及進展中呈異常表達，因此，篩選在腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)異常表達的miRNA，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及確診提供了可能。有研究表明[10]，在肝癌細胞中miR-224呈過表達，并與病人預(yù)后密切相關(guān)。Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-224與乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Rokavec等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-224與食管癌發(fā)生及進展密切相關(guān)，可以作為食管癌基因治療的靶點。本研究首先在檢測中發(fā)現(xiàn)，miR-224在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)，結(jié)合以往研究提示miR-224在結(jié)腸癌發(fā)生進展過程中可能發(fā)揮重要作用，反義寡核苷酸技術(shù)是通過構(gòu)建或人工合成的反義表達載體表達的寡核苷酸片段，能夠起到干預(yù)基因正常解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、加工、轉(zhuǎn)運等各環(huán)節(jié)，為進一步研究miR-224在結(jié)腸癌細胞中的作用，本研究中通過反義寡核苷酸技術(shù)降低了結(jié)腸癌細胞SW480中miR-224的表達，同時，利用克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞增殖情況，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，從而就miRNA在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡過程中的生物學(xué)性能進行系統(tǒng)的研究[13]，相比于單純就腫瘤細胞中miRNA表達情況的研究，本研究比較系統(tǒng)、直觀，說服力更強，選取的指標(biāo)更能夠為其生物學(xué)性能提供可靠的實驗室證據(jù)。本研究顯示，miR-224基因在結(jié)腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的相對表達量顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miR-224與結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)，并可能與腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在結(jié)腸癌病理過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果顯示，反義miR-224組人結(jié)腸癌SW480細胞克隆形成率顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明miR-224在結(jié)腸癌細胞成長過程中發(fā)揮重要作用。同時，本研究采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況顯示，反義miR-224組人結(jié)腸癌SW480細胞凋亡指數(shù)高于對照組(P<0.05)，表明miR-224與結(jié)腸癌細胞凋亡密切相關(guān)。目前，已有的研究已充分證實Bcl-2與細胞凋亡密切相關(guān)[14]，Bcl-2是Bcl-2家族最有代表性的凋亡抑制因子，主要存在于核膜、線粒體外膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，表達產(chǎn)物能夠有效降低各種刺激所引發(fā)的細胞凋亡。本研究為探討miR-224在結(jié)腸癌細胞中發(fā)揮作用是否與其他蛋白有關(guān)，同時，參考有關(guān)文獻報道[15]，對不同轉(zhuǎn)染組細胞Bcl-2表達情況進行了檢測。本研究結(jié)果顯示，反義miR-224組細胞Bcl-2 mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.05)，提示反義miR-224通過抑制結(jié)腸癌細胞中Bcl-2表達而加速細胞凋亡發(fā)生，進一步實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖過程的調(diào)控作用，下一步，我們將對miR-224與Bcl-2相關(guān)性及可能的作用機制進一步進行探討。

1 韓雪, 黃辰曦, 趙佳, 等.上海市楊浦區(qū)2002-2012年戶籍人口結(jié)直腸癌發(fā)病和生存分析.中華流行病學(xué)雜志,2014,35:289-294.

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Expression of antisense miR-224 in colon cancer and its effect on cancer cell proliferation

HuGang,ZhanHui.

DepartmentofGeneralSurgery,HuangshiCentralHospital,Huangshi435000,China

Correspondingauthor:ZhanHui,Email: 240690712@qq.com

Objective To explore the expression of miR-224 in colon cancer and examine its effect on the proliferation and apoptosis of cancer cell.Methods A total of 134 cases of colon cancer and adjacent tissue specimens were collected from Feb. 2011 to Mar. 2014. And the expression of miR-224 was detected by real-time polymerase chain reaction (PCR). Human colon cancer cell SW480 was transfected by miR-224 antisense oligonucleotide and cultured. The effects of miR-224 antisense oligonucleotide on cellular proliferation and apoptosis were detected by colony formation assay and flow cytometry. And the expressions of Bcl-2 in differentially transfected cells were detected by real-time PCR and Western blot.Results The relative expression of miR-224 was significantly higher in colon cancer tissue than that in adjacent tissues. And the difference was statistically significant (P<0.05). The colony formation rate of SW480 human colon cancer cell in antisense miR-224 group was significantly lower than that in control group while the apoptotic index was higher. And the differences were statistically significant (P<0.05). The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein were lower in antisense miR-224 group than those in control group. And the differences were all statistically significant (P<0.05).Conclusions There is an over-expression of miR-224 in colon cancer. And its down-regulation may effectively inhibit the proliferation and accelerate the apoptosis of colon cancer cell. It will probably become a new target for early detection and gene therapy of colon cancer.

Colon cancer; miR-224; Antisense oligonucleotide; Expression; Cell proliferation

435000 湖北黃石，黃石市中心醫(yī)院普外一科

湛匯，Email:240690712@qq.com

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.01.012

2014-11-06)