朱志堅，于燕妮，陶 欣，鄧超男

（貴州醫(yī)科大學病理教研室，貴州貴陽 550004）

沉默Smo基因對大鼠原代軟骨細胞增殖與凋亡的影響

朱志堅，于燕妮*，陶 欣，鄧超男

（貴州醫(yī)科大學病理教研室，貴州貴陽 550004）

目的 觀察沉默Smo基因后對大鼠原代軟骨細胞增殖與凋亡的影響。方法 用機械-酶消化法獲取原代大鼠軟骨細胞，經(jīng)免疫細胞化學Ⅱ型膠原（ColⅡ）鑒定后，將實驗分為對照組、control siRNA組和SmosiRNA 1～3組，以慢病毒為載體將siRNA轉入軟骨細胞，72 h后，MTT法檢測細胞活力;反轉錄PCR（RT-PCR）及蛋白印跡（Western blot）檢測Smo的表達量;流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果 各組序列經(jīng)慢病毒載體成功轉染到原代軟骨細胞中，SmosiRNA1～3均不同程度的抑制Smo的表達，以SmosiRNA2組最為明顯，其mRNA及蛋白的表達分別為0.19±0.03和0.39±0.07;同時，SmosiRNA2組細胞活力最低（77.38% ±7.19%）而凋亡率最高（21.43% ±2.97%）。結論 沉默Smo可抑制原代軟骨細胞增殖，并誘導軟骨細胞凋亡，Smo具有保護軟骨細胞免遭凋亡的作用。

原代軟骨細胞;慢病毒載體;siRNA;凋亡;增殖

Hh信號通路是一條經(jīng)典的胚胎發(fā)育和分化信號系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育過程中對細胞分化和增殖起重要作用，同時可以促進許多成熟器官創(chuàng)傷愈合。7次跨膜蛋白（Smoothened，Smo）為Hh信號通路上的膜蛋白，是Hh信號通路的轉換器，對Hh信號傳導至關重要，可以把細胞外的Hh信號轉換成細胞內Gli（神經(jīng)膠質瘤關聯(lián)癌基因同源物，glioma assocuated oncogene homolog，Gli）信號，引發(fā)細胞內信號下傳，激活轉錄因子 Gli［1］，從而激活下游的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞內有Smo的表達［2-3］，但對軟骨細胞的生長產(chǎn)生何種作用的研究相對少見，本實驗應用RNA干擾技術（siRNA）沉默Smo基因，觀察沉默后軟骨細胞增殖與凋亡的情況，探討Smo對體外培養(yǎng)的原代軟骨細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD乳鼠［清潔級，貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號:ISCXK（黔）2012-0001］;胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）;胰蛋白酶（Thermo公司）;Ⅱ型膠原蛋白酶（Sigma公司）;含干擾序列慢病毒液（上海吉瑪公司包裝合成）;促轉染試劑Polybrene（Sigma公司）;MTT（北京鼎國公司）;兔抗鼠ColⅡ多克隆抗體（武漢博士德公司）;兔抗鼠 Smo、Bcl、Bax多克隆抗體（Santa Cruz公司）;SP-9000免疫組化試劑盒（北京中杉生物公司），Annexin V-FITC/PI（Invitrogen公司）;RIRA裂解液、PMSF（上海碧云天生物技術有限公司）;辣根酶標記山羊抗兔IgG和SDS-PAGE試劑等（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞的分離及鑒定:取大鼠膝關節(jié)軟骨組織，軟骨細胞的分離及培養(yǎng)參照文獻［4］。采用II型膠原（Col II）免疫組織化學方法對其細胞進行鑒定，步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 分組與處理:將軟骨細胞以每孔2×105個接種于6孔板，實驗設空白對照組、control siRNA組、SmosiRNA1～3組，每組6個平行樣，將帶有siRNA的慢病毒感染軟骨細胞，同時在每孔加入促轉染試劑Polybrene（5 mg/L）以促進感染率，72 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞內熒光蛋白的表達，并計算病毒感染效率，感染效率（%）=熒光視野下細胞數(shù)/普通視野下細胞數(shù)×100%。control siRNA序列為:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3'，SmosiRNA1序列為:5'-GCATCTGCTTTGTAGGCTACA-3'，SmosiRNA2 序列為:5'-GCAAGATCAATGAGACC ATGC-3'，SmosiRNA3 序列為:5'-GCTCGAAGAGG AGCCATATTA-3'，序列片段均由上海吉瑪技術有限公司提供合成。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:取生長狀態(tài)良好的軟骨細胞，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，每組設6個復孔，感染軟骨細胞72 h后，棄掉各孔培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基 200 μL，再加入 20 μL（5 g/L）的噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），繼續(xù)孵育4 h;棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL二甲基亞砜，振蕩混勻，用酶標儀于490 nm波長處測其吸光度（A）值，細胞的增殖活性（%）=（A轉染組－A空白組）/（A對照組－A空白組）×100%。

1.2.4 RT-PCR檢測SmomRNA表達水平:轉染72 h后參照RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA后進行Smo基因擴增。引物由上海生工公司合成，Smo上游引物:5'-AAGAAGAAGCGG AGGAAGAGG-3'，下游引物:5'-AGG GGCAGAGTGG TGAAGTT-3';β-actin上游引物:5'-CGTAAAGACC TCTATGCCAACA-3'，下游引物:5'-AGCCACCAA TCCA CACAGAG-3'。PCR 反應體系 20 μL，反應條件:94℃ 2 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析。

1.2.5 Western blot檢測 Smo、Bax、Bcl-2 的表達:轉染72 h后，提取細胞總蛋白，蛋白定量后經(jīng)10%SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF膜上，依次加人封閉液、兔抗鼠 Smo、Bcl、Bax 多克隆抗體（1∶200）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（1∶3 000），再經(jīng)化學發(fā)光劑反應，X線片壓片曝光。將曝光后的條帶掃描并用Image J分析數(shù)據(jù)，以相應蛋白條帶的平均吸光度值表示所測蛋白的相對強度。以β-actin蛋白條帶作為內參照，最后數(shù)據(jù)以蛋白質表達的相對水平比來表示。

1.2.6 Smo沉默后細胞凋亡的檢測:根據(jù)Western blot及RT-PCR結果選出最適SmosiRNA干擾片段，將實驗分3組:對照組;control siRNA組;SmosiRNA2組。轉染72 h后，胰蛋白酶消化收集細胞，對細胞進行Annexin V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分比。

圖2 慢病毒感染軟骨細胞Fig 2 Chondroncytes transfected with lentivirusin（×100）

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 原代軟骨細胞形態(tài)及鑒定

原代軟骨細胞呈三角形、梭形、多角形或不規(guī)則形，胞質豐富，核大而圓，可見多個核仁（圖1A）。ColⅡ免疫組化發(fā)現(xiàn)軟骨細胞胞質內被染成棕黃色顆粒（圖1B）。

圖1 原代軟骨細胞形態(tài)及鑒定Fig 1 The morphological characteristics and the identify result of primary chondrocyte（×100）

2.2 軟骨細胞慢病毒感染結果（圖2）

2.3 干擾后細胞增殖活力

SmosiRNA2及SmosiRNA3組細胞活力低于對照組及control siRNA組（P＜0.05），SmosiRNA1組細胞活力與對照組及control siRNA組無明顯差異（表1）。

2.4 干擾后Smo基因mRNA表達

control組、control siRNA 組、SmosiRNA1～3組SmomRNA表達量分別為0.31±0.03、0.32±0.02、0.29±0.04、0.19±0.03、0.25 ±0.03。SmosiRNA2組及SmosiRNA3組SmomRNA的表達量明顯低于與對照組及control siRNA組（P＜0.05）（圖3）。

表1 轉染后細胞活力Table 1 The cell viability of chondroncytes after transfected with lentivirus in different groups（x ± s，n=6）

圖3 轉染后軟骨細胞Smo mRNA表達Fig 3 Expression of Smo mRNA of rat chondroncytes after transfected in different groups

2.5 干擾后Smo基因蛋白表達情況

SmosiRNA1～3均可不同程度地抑制Smo的表達，以SmosiRNA2表達量最低（P＜0.05）（圖4，表2）。

圖4 轉染后軟骨細胞Smo、Bcl-2、Bax蛋白表達Fig 4 Expression of Smo，Bcl-2 and Bax protein of rat chondroncytes after transfected in different groups

表2 轉染后大鼠軟骨細胞 Smo、Bcl-2及Bax平均吸光度值Table 2 Average absorbance value of Smo，Bcl-2 and Bax of rat chondroncytes after transfected in different groups（x ± s，n=6）

2.6 細胞凋亡

對照組、control siRNA組及SmosiRNA2組細胞凋亡率分別為9.63% ±1.94%、13.90% ±2.88%和21.43%±2.97%。SmosiRNA2組細胞凋亡率明顯高于其余兩組（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

Smo蛋白由原癌基因Smothened編碼，是Hh信號傳遞所必須的受體，在Hh信號通路介導的細胞增殖及凋亡起著重要調節(jié)作用。當Hh蛋白缺乏時，Smo蛋白與Ptc結合，從而抑制Smo的活性;當Hh蛋白存在時，Ptc與Hh結合，解除對Smo的抑制作用，激活后的Smo可以將胞外Hh信號轉換成胞內Gli信號，進而激活Hh信號通路的下游Bcl-2、CyclinD等因子的表達，調節(jié)細胞的增殖與凋亡［5］。本實驗應用RNA干擾技術沉默Smo因子，以了解Smo對原代軟骨細胞增殖與凋亡的作用。由于軟骨細胞可以特異性分泌Ⅱ型膠原［6］，故本實驗采取機械-酶消化法獲取細胞后，應用ColⅡ染色的方法對其鑒定，結果顯示細胞的胞質內被染成棕黃色，提示原代軟骨細胞分離成功。

圖5 軟骨細胞凋亡Fig 5 The results of chondrocyte apoptosis in different groups

目前，轉染載體主要分為病毒載體和非病毒載體。由于慢病毒對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合實驗中難于轉染的細胞，并且具有RNA干擾作用時間持久，免疫原性小等優(yōu)點［7-8］，為此，本實驗采用慢病毒作為載體進行轉染，該實驗中的3組siRNA是針對大鼠Smo基因序列不同位點特異性設計并合成的，通過病毒載體將3對siRNA分別轉染到體外培養(yǎng)的原代軟骨細胞內，并設立陰性對照組評價轉染效率。轉染72 h后通過提取RNA及蛋白發(fā)現(xiàn)SmosiRNA2組的抑制效率明顯強于SmosiRNA1及SmosiRNA-3組，提示轉染72 h后，基因沉默的效果就已經(jīng)顯現(xiàn)，針對同一基因的不同部分的siRNA基因沉默效率不同，與報道相一致［9-10］;通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)SmosiRNA2組細胞活力低于其他各組，提示，在正常情況下，Smo因子的表達有利于軟骨細胞的增長;并且，SmosiRNA2組的凋亡率明顯高于其他組，提示Hh信號通路具有保護軟骨細胞免遭凋亡的作用，下調Smo的表達可抑制軟骨細胞的增殖促進軟骨細胞的凋亡，與其他報道相一致［11-12］，轉染結果表明 Smo對細胞有一定保護作用。在骨關節(jié)炎、氟性關節(jié)損傷等軟骨疾病中，均能導致軟骨細胞的凋亡［13-14］，Smo因子可保護軟骨細胞免遭凋亡，能否通過上調Smo的表達而達到治療疾病，尚有待進一步的實驗研究。

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The effects of silencingSmogene on proliferation and apoptosis of rat primary chondrocyte

ZHU Zhi-jian，YU Yan-ni*，TAO Xin，DENG Chao-nan
（Dept.of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of silencing Smo gene on proliferation and apoptosis of rat primary chondrocyte in vitro.MethodsThe primary chondrocyte was obtained by mechanical-enzyme digestion and identified by Immunohistochemical cells（ColⅡ）.The animals were divided into control group，control siRNA group andSmosiRNA 1 ～ 3 group.The siRNA was transfected into chondrocytes by lentivirus vector.After 72 h，the cell viability was detected by MTT，Smo expression was detected by RT-PCR and Western blot，and the apoptosis of chondrocyte was assessed by flow cytometry.ResultsAll types of siRNA were transfected into primary chondrocyte by vectors，theSmosiRNA 1 ～ 3 may inhibit the expression ofSmomRNA and protein in chondrocytes，andSmosiRNA2 had the highest silencing rate（the expressions ofSmomRNA and protein were 0.19±0.03 and 0.39±0.07）.The cell viability inSmosiRNA2 group was lowest（77.38% ±7.19%），while the apoptosis rate ofSmosiRNA2 was highest（21.43% ±2.97%）.ConclusionsSilencingSmogene in primary chondrocytes may inhibit proliferation and promote apoptosis，Smomay have a protecting role from apoptosis of the chondrocyte.

primary chondrocytes;lentiviral vector;siRNA;apoptosis;proliferatio

R336

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.012

1001-6325（2015）09-1209-05

2015-03-27

2015-06-26

國家自然科學基金（81260419）;教育部博士點基金（博導類）（20125215110001）

*通信作者（corresponding author）:gyyxybl2010@163.com