劉永峰，庫 婷，高俊嶺，楊興斌

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119）

超低溫凍藏牛奶中?；蚪MDNA的提取方法

劉永峰，庫 婷，高俊嶺，楊興斌

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119）

采用不同的解凍方法以及牛奶體細胞分離與SDS苯酚法相結合的手段，分離提?。?0℃凍藏牛奶中?；蚪MDNA，利用超微量核酸分析儀和瓊脂糖凝膠電泳法分別對DNA濃度、純度及分子量大小進行檢測，采用PCR技術擴增牛特異性基因序列片段進行DNA質(zhì)量鑒定。結果表明，“兩步法”解凍提取的?；蚪MDNA的質(zhì)量優(yōu)于“一步法”和“三步法”，且該方法所提取的DNA濃度為（52.46±2.40）μg／mL，DNA純度為1.85±0.80，條帶較清晰；PCR擴增證實這些DNA可以成功擴增出729bp的牛特異性基因序列片段。本研究成功優(yōu)化了牛奶中DNA的分離提取方法，篩選出了凍藏牛奶的適宜解凍方法，建立了一種新的超低溫凍藏牛奶中?；蚪MDNA提取方法。

牛奶；解凍方法；DNA提取；PCR

隨著分子生物技術的日益發(fā)展，該技術也逐漸被牛奶質(zhì)量檢測及安全的深入研究所采用。Schennink等［1］研究發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛的牛奶中脂肪酸不飽和度指數(shù)的變化，可以通過特異基因選擇來提高牛奶不飽和脂肪酸的含量。Wang等［2］開展了以色列荷斯坦牛的牛奶品質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)牛奶的乳蛋白率與基因調(diào)控有顯著關系，研究結果為改善牛奶質(zhì)量性狀提供了參考依據(jù)。1999年，Lipkin等［3］首次提出將牛奶作為獲取DNA的來源，建立了一種從牛奶中提取DNA的方法。田雨［4］在此基礎上優(yōu)化了從牛奶中分離DNA的方法，將體細胞分離技術與高溫裂解技術相結合提取DNA，但是結果與理想狀態(tài)存在一定差距。本實驗室前期也開展了新鮮牛奶中?；蚪MDNA提取方面的研究，成功提取了基因組DNA［5］。牛奶中牛基因組DNA的提取可以避免從血液、組織中提取DNA對奶牛正常生理狀態(tài)造成影響這一問題，也可為從分子水平上研究奶牛生產(chǎn)性能及牛奶品質(zhì)提供新型、便捷的方法。但是，目前這些研究均以新鮮牛奶作為DNA提取材料，尚無從凍藏牛奶中提取DNA方面的研究。因此，本研究將以凍藏在－80℃的牛奶作為DNA提取材料，篩選合適的解凍方法，優(yōu)化牛奶中?；蚪MDNA的提取方法，為深入研究牛奶品質(zhì)、判斷牛奶是否摻假提供了良好的DNA來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

－80℃超低溫冷凍冰箱保存的牛奶樣品，保藏2年，采自于西安綜合開發(fā)總公司畜牧分公司奶牛場的12頭奶牛。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

（1）磷酸緩沖液（PBS）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，溶于800mL雙蒸水中，調(diào)pH至7.4，定容至1 000mL，使用時高壓滅菌。

（2）OP乳化劑：90%Triton－X100 20mL，95%乙醇125mL，0.9g／L NaCl 855mL。

（3）1mol／L Tris－Cl（pH 8.0）：Tris 121.1g，溶于800mL雙蒸水中，調(diào)pH至8.0，定容至1 000mL。

（4）0.5mol／L EDTA（pH 8.0）：EDTA 186.1g，調(diào)pH至8.0，定容至1 000mL，高壓滅菌。

（5）DNA提取緩沖液：NaCl 2.925g，1mol／L Tris－HCl 25mL，0.5mol／L EDTA 5mL，調(diào)pH至7.5～8.0，雙蒸水定容至500mL。

（6）20%SDS裂解液：SDS 20g，溶于80mL雙蒸水，調(diào)pH至7.2，定容至100mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（7）TE緩沖液：1mol／L Tris－Cl（pH 8.0）4 mL，0.5mol／L EDTA 0.4mL，定容至200mL。

（8）氯仿∶異戊醇＝24∶1。

（9）苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1。

（10）50×TAE貯液：Tris Base 121g，冰乙酸28.55mL，0.5mol／L EDTA（pH 8.0）50mL，pH調(diào)至8.0～8.4，定容至500mL，常溫儲存。電泳時稀釋50倍，即工作濃度1×TAE。

1.2.2 主要儀器設備 超高速低溫離心機（3k30，美國Sigma公司）；低速大容量離心機（DL－4C，上海安亭科學儀器廠）；高速離心機（TGL－16G，上海安亭科學儀器廠）；精密微量移液槍（德國Eppendorf）；電泳儀（DYY－4C，北京市六一儀器廠）；全自動凝膠成像分析儀（JS－680B，上海培清科技有限公司）；梯度PCR儀（BLO－RAD）；超微量核酸分析儀（Na－200，杭州艾普儀器設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 奶樣的解凍處理方法 對奶樣解凍時間進行預試驗，摸索奶樣直接解凍和分溫度梯度解凍需要的時間。根據(jù)解凍指標篩選結果，取出凍藏于－80℃的9個奶樣，分成三組，三組用不同的解凍方法進行解凍。第一組（A11、A12和A13）是用常溫下自來水沖洗解凍的3個奶樣，即一步法；第二組（A21、A22和A23）是將3個奶樣于4℃處理290 min后常溫自來水沖洗解凍4min，即兩步法；第三組（A31、A32和A33）是將3個奶樣先在－20℃緩存120min，再于4℃處理190min后，常溫自來水沖洗解凍3min，即三步法。

以上三種方法，用常溫自來水沖洗解凍終止的標準是固態(tài)奶樣經(jīng)輕輕搖動離心管可以變形的狀態(tài)。

1.3.2 DNA提取方法

（1）牛奶體細胞分離與富集

將解凍的奶樣于超高速低溫離心機中在7 500 r／min，4℃下離心30min。用小勺刮去離心管上層的乳脂，用吸管將中間層的乳蛋白去掉，留下最底部的一層的沉淀。向離心管底部加入600μL PBS，將底部沉淀捶打懸浮并轉移至1.5mL的離心管中，12 000r／min常溫離心10min，棄去上層液體，保留底部沉淀。再向底部沉淀加乳化劑60μL、PBS 540 μL，用振蕩器振蕩至沉淀完全懸浮，40℃恒溫水浴處理10min脫去體細胞周圍的乳脂，12 000r／min常溫離心10min，棄上清，加PBS 500μL懸浮沉淀，于12 000r／min低溫離心10min使體細胞沉淀富集，棄上清。

（2）牛奶體細胞消化

向體細胞沉淀中加入350μL的DNA提取緩沖液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化過夜。

（3）SDS苯酚法提取DNA

為了準確高效地提取DNA，本研究采用SDS苯酚法提取DNA。

首先，向消化產(chǎn)物中加等體積的Tris飽和酚溶液，來回顛倒10min，12 000r／min低溫離心10 min，得到上清液；將上清液轉移到另一個1.5mL離心管中，加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，酚、氯仿和異戊醇按體積比為25∶24∶1配制，來回顛倒10min，使沉淀溶解，12 000r／min離心10min，得到上清液；再將上清液轉移到另一個1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿和異戊醇混合物，氯仿和異戊醇按體積比為24∶1配制，來回顛倒10 min，使沉淀溶解，12 000r／min離心10min，得到上清液。

（4）核酸沉淀

將上清液轉移到另一個1.5mL的離心管，加入2倍體積的冰無水乙醇（－20℃）沉淀，輕輕振搖，－20℃，靜置30min，12 000r／min離心10 min，棄去上層乙醇。底部沉淀用70%冰乙醇（－20℃）洗滌，12 000r／min，低溫離心10min，小心去除上層乙醇，快速揮發(fā)乙醇，加入25μL的TE溶解DNA，－4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測方法 基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳［6］。取DNA提取液3 μL，6×DNA Loading Buffer溶液1μL，混合后上樣。100V穩(wěn)定電壓下電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。

1.3.4 DNA濃度、純度的檢測方法 利用超微量核酸分析儀測定DNA濃度和純度（OD260／280）值，取2μL DNA樣品直接測得DNA濃度和純度值。

1.3.5 PCR擴增 根據(jù)NCBI中牛B2M（NM＿007308）基因序列，經(jīng)Primer 5軟件分析設計了一對擴增編碼區(qū)的引物，上游引物：5'GGC TTT CCC AGC ATC ACT AAC 3'，下游引物：5'TCA CAG CAC CAC CAA ACT TAT CT 3'，擴增729bp的片段。

用于擴增編碼區(qū)片段的10μL PCR反應體系：牛基因組DNA 1μL，2×Taq Master Buffer（5 mmol／L Mg2+）3.3μL，NTP（各2.5mmol／L）1 μL，上游引物（10pmol／μL）0.3μL，下游引物（10 pmol／μL）0.3μL，Taq DNA聚合酶（5U／μL）0.1 μL，ddH2O補至10μL。

PCR循環(huán)：94℃5min預變性；（94℃30s，60℃30s，72℃30s）×30cycles；72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 不同解凍方法奶樣中DNA濃度和純度的檢測結果

以不同解凍方法從凍藏牛奶中提取的?；蚪MDNA濃度和純度的檢測結果見表1。通過統(tǒng)計學分析得知，不同奶樣以同種解凍方法處理得到的DNA濃度和純度差異均不顯著（P＞0.05），但是不同解凍方法間DNA濃度和純度差異顯著（P＜0.05），說明奶樣的解凍方法對DNA濃度和純度的影響較大?！耙徊椒ā苯鈨鎏幚淼玫紻NA平均濃度為462.50μg／mL，“兩步法”為52.46μg／mL，“三步法”為27.67μg／mL；“一步法”解凍處理得到DNA平均純度為1.32，“兩步法”為1.85，“三步法”為1.81。據(jù)報道，DNA純品的純度高于1.9說明可能含有RNA，而低于1.6說明可能含有蛋白質(zhì)、酚類等污染［7］。另外，不同方法的解凍過程中，由于肽類分子會有不同程度的降解，蛋白質(zhì)變性程度也不同，去污劑和有機溶劑酚、氯仿等的作用會使OD260／／280比值發(fā)生不同程度的改變［8－9］。因此，“一步法”得到的DNA濃度較高，這很大程度上是由于純度低造成的，“一步法”解凍的奶樣在相對較高的溫度下放置時間較長，核酸與蛋白質(zhì)及其他成分結合越緊密。在DNA提取過程中，DNA很難徹底與其分離，進而造成DNA濃度異常偏高［10］。因此，綜合DNA的濃度和純度來看，“兩步法”為提取分離牛奶中?；蚪MDNA的最優(yōu)方法。

2.2 不同解凍方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

凝膠電泳結果如圖1。三種解凍方法提取的DNA分子量均符合真核動物的DNA大小，且條帶整齊單一?！耙徊椒ā钡玫降腄NA片段較亮，但是降解嚴重，拖尾現(xiàn)象很明顯；“兩步法”得到的DNA片段亮，略有拖尾及彌散現(xiàn)象；“三步法”得到的DNA片段較暗，也略有拖尾及彌散現(xiàn)象。綜合比較三種方法，兩步法提取分離獲得的牛DNA質(zhì)量最好。

表1 三種解凍方法對不同奶樣DNA濃度和純度的影響結果Tab.1 Effect results of three thawing ways on DNA concentration and purity of milk samples

圖1 提取的DNA凝膠電泳檢測結果Fig.1 The detection results of DNA agarose gel electrophoresis

2.3 不同解凍方法提取DNA的PCR擴增檢測結果

圖2 DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結果Fig.2 The identified results of PCR amplifying products with DNA gel electrophoresis

為了進一步驗證三種解凍方法所提取DNA是否為牛的基因組DNA，本研究參照其他物種的驗證方法［11－13］，進行了特異性引物的PCR擴增，結果見圖2。結果顯示等量的DNA模板，不同解凍方法PCR擴增的特異性目的條帶均比較單一，且與729bp的特異性引物擴增片段目的大小基本一致。說明本研究從冷藏牛奶中提取的DNA均為?；蚪MDNA。從PCR產(chǎn)物條帶的亮度來看，三種解凍方法中，以“兩步法”所提取的DNA作為模塊，擴增得到目的序列條帶最亮，效果最好。

3 討論

在DNA提取過程中，DNA質(zhì)量會受到諸多因素影響，原料保存時間和溫度是常見的兩個重要因素［14］，一般采用控制溫度的辦法。解凍是將凍結品融解后而復原其生鮮狀態(tài)，然而凍結品放置在自然條件下也會復原，所以解凍這道工序往往就被忽視。有研究結果發(fā)現(xiàn)，溫度劇烈變化可引起細胞化學結構不同程度的改變，能量代謝紊亂，DNA鏈的完整性遭到破壞等［15］。然而，高質(zhì)量的DNA有許多要求，如保持DNA分子完整性、高分子量、無明顯降解現(xiàn)象、高純度，以及高獲取效率等［16－17］。因此，要獲得高質(zhì)量的DNA，樣品從低溫保存、解凍到DNA提取的整個過程，都應同等重視。

對于選擇－80℃超低溫凍藏牛奶提取?；蚪MDNA的原因。牛奶中由于乳糖及鹽類的含量變化較小，因此冰點也很穩(wěn)定，平均冰點為－0.54℃［18］，這就為牛奶保存溫度的控制奠定了基礎。吳曉黎［14］等對全血保存條件的研究表明，在－80℃較長時間儲存DNA提取材料可以確保能獲得高質(zhì)量的DNA。因此，我們將牛奶在－80℃進行速凍為了能以最快的速度通過牛奶的最大冰晶區(qū)，避免出現(xiàn)牛奶細胞內(nèi)冰晶的形成而破壞細胞的結構，以保證凍藏奶樣中較高質(zhì)量的DNA［18－19］。

對于長時間超低溫凍藏的牛奶仍可以保證其DNA的質(zhì)量良好?？赡苡幸韵?個方面的原因：（1）低溫能使細胞內(nèi)核酸酶的活性降低，酶解反應基本被抑制，有利于保持DNA的完整性和得率；（2）牛奶中的水分占到87%～89%，是牛奶的主要組成成分，而水是各種生化反應完成必需的介質(zhì)，奶樣經(jīng)冷凍結冰后，這種介質(zhì)消失，也就阻礙了奶樣中的各種生化反應，對保持DNA分子的質(zhì)量也起到了一定的作用；（3）在－80℃超低溫條件下，微生物活動受到影響，這在很大程度上抑制了微生物反應，有利于保持DNA質(zhì)量良好。

綜合考慮所獲DNA的濃度、純度、DNA凝膠電泳結果和PCR擴增產(chǎn)物電泳結果，確定“兩步法”為最優(yōu)處理方法?！耙徊椒ā苯鈨龅腄NA濃度值高于“兩步法”和“三步法”所測的值，這可能是因溫度驟變，牛奶體細胞結構發(fā)生變化，在DNA提取時細胞裂解的更徹底，使各種細胞器游離在裂解液中，特別是含有核酸成分的線粒體，這樣，在某種程度上也就增加了DNA濃度偏高的機率。但是，“一步法”得到的DNA純度是最低的，這可能是由于細胞其他內(nèi)容物在相對較高溫度下與核酸成分作用時間較長，從而增加了除雜的難度，使得DNA純度偏低?！叭椒ā钡玫紻NA的純度雖然很高，但是濃度太低，這可能是因奶樣由－80℃放到－20℃，再到4℃，溫度反復波動，使牛奶的品質(zhì)進一步劣變，間接影響了DNA的質(zhì)量。無論是溫度的驟變還是溫度的反復波動，都會加速核酸的分解，使DNA提取質(zhì)量降低。而“兩步法”既避免了溫度的驟變，又減少了溫度波動的頻率，所以可以在保證濃度較高的情況下，純度也可以保持相對較高；同時，PCR擴增結果也證實了“兩步法”提取出的DNA擴增效果更好。除解凍溫度對DNA質(zhì)量有影響外，解凍時間也是一個重要的因素，然而解凍時間又受到解凍溫度的限制。本研究篩選出的最佳解凍方法是在保證溫度較低的基礎上，選擇較短的解凍時間，結果得到的DNA質(zhì)量較理想。因此，從超低溫凍藏牛奶中提取牛基因組DNA過程中，應該平衡解凍溫度與時間之間的相互制約關系，提高DNA質(zhì)量。

4 結論

從超低溫凍藏牛奶中提取?；蚪MDNA的前處理過程中，解凍方法會影響牛奶中牛基因組DNA的質(zhì)量。經(jīng)過檢測DNA濃度、純度，觀察DNA瓊脂糖凝膠電泳結果和牛特異性基因PCR結果，篩選出了較為理想的解凍方法，即“兩步法”，優(yōu)化了超低溫凍藏牛奶中牛基因組DNA提取方法，為在基因水平解析牛奶質(zhì)量的研究工作奠定了良好基礎。

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〔責任編輯 宋軼文〕

Study on cattle genomic DNA extraction from milk preserved at ultra－low temperature

LIU Yongfeng，KU Ting，GAO Junling，YANG Xingbin
（School of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710119，Shaanxi，China）

Three thawing methods，milk somatic cell separation technique and SDS phenol method were used to separate and extract bovine genomic DNA from milk samples preserved at－80℃. The concentration and purity of the extracted DNA were measured by the ultra low volume spectrometer，and molecular weight of DNA was obtained by agarose gel electrophoresis.The DNA quality was further identified by PCR to amplify specific bovine gene fragment.The results showed that DNA obtained from the two－step thawing method was better in quality than that from the one－step thawing method and three－step thawing method.The concentration and purity of the DNA from the two－step method were（52.46±2.40）μg／mL and 1.85±0.80，respectively.The specific bovine gene fragment（729bp）could be successfully amplified，and the strip on gel image was clear.This study established a novel bovine genomic DNA extraction method from milk preserved at ultra－low temperature，by optimizing method for thawing frozen milk.

milk；thawing method；DNA extraction；PCR

Q523

：A

1672－4291（2015）06－0094－06

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.06.164

2015－03－19

陜西省青年科技新星項目（2014KJXX－51）；陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關項目（2014K01－19－02）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（GK201502008）；中國博士后科學基金（2015M570811）

劉永峰，男，副教授，主要從事畜產(chǎn)品科學與營養(yǎng)研究。E－mail：yongfeng200＠126.com