王永良

(龍門縣人民醫(yī)院，廣東 龍門516800)

Selmi C最初發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清中miR-132和miR-212的表達(dá)均有變化，miR-132與miR-212在血清中的表達(dá)與免疫力相關(guān)[1]。故近5年多項(xiàng)研究均將miR-132與miR-212的靶向作用進(jìn)行研究，miR-132已被確認(rèn)為血管再生開關(guān)因子，miR-212已被確認(rèn)為細(xì)胞有絲分裂開關(guān)因子。此二者對(duì)肝硬化的修復(fù)過程均具有現(xiàn)實(shí)意義[2，3]。肝硬化患者的miR-132和miR-212的表達(dá)均有降低，檢測(cè)血清miR-132和miR-212對(duì)肝硬化的診斷具有積極意義。

表1 患者一般資料表

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年4月至2014年4月來我院參與肝硬化治療的患者63例，其中男性42例，女性21例，年齡 32~67歲，平均年齡 45±1.2歲。所有患者均為龍門地區(qū)漢族人群。患者合并腹膜炎的33例，腸系膜炎32例，門靜脈高壓患者41例，淤血性脾大患者39例，腹水患者17例。全部患者有飲酒史，日均飲酒50ml以上的21例。所有患者中，代償期肝硬化22例，失代償期肝硬化患者41例。見表1。

1.2 標(biāo)本采集方法 采用一次性真空采血管采集患者空腹靜脈血5ml。置于離心機(jī)中，使用10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。取上清液(血清)置于-80℃保存。

1.3 RNA提取方法 取樣本血液1ml，置于離心機(jī)中10000r/min離心處理1.5min。取血清200μl加入200μlTrizol裂解劑，充分震蕩，提取總RNA。

1.4 PCR反應(yīng)及miRNA逆轉(zhuǎn)錄方法 提取的RNA溶解于 11 μl DEPC-treated water， 加入 1μl Oligo(dT)18 primer(0.5μg/μl) 輕微震蕩后離心 3~5s，在PCR擴(kuò)增儀上70℃5min。冰上冷卻，并短暫離心，向反應(yīng)體系中加入 5×reaction buffer 4μl，Ribolock-TMRibonuclease inhibitor(20U/μl)1μl，10 mM dNTP mix 2μl。輕微震蕩后離心3~5s，在PCR擴(kuò)增儀上37℃ 5min。向反應(yīng)體系中加入 RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)1μl，在 PCR擴(kuò)增儀上42℃ 60min，70℃ 10min。引物設(shè)計(jì)使用廣州銳博公司的標(biāo)準(zhǔn)序列。退火溫度為60℃，產(chǎn)物片段106bp，以U6標(biāo)準(zhǔn)作為內(nèi)參考[4]。

1.5 生化分析方法 備份血液樣品進(jìn)行GGT、ALP、ALT及TBil等肝功能項(xiàng)目檢測(cè)，使用生化分析儀及配套試劑完成[5-8]。所有操作均按說明書嚴(yán)格操作，因此操作過程與本文實(shí)質(zhì)研究結(jié)果并無直接關(guān)系，在此不做贅述。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)量資料用x+s表示；多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)兩兩間的比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，兩變量之間關(guān)系采用 Pearson相關(guān)性分析;以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化及臨床檢測(cè)結(jié)果 在總膽紅素(T Bil)、直接膽紅素(D Bil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)等指標(biāo)中，研究組均與實(shí)驗(yàn)組具有明顯差異，特別是代表肝臟損傷的ALP和GGT指標(biāo)，研究組明顯高于健康組。膽堿脂酶(CHE)C反應(yīng)蛋白(CRP)血沉(ESR)兩組患者基本相似。見表2。

表2 各組對(duì)象生化及臨床指標(biāo)對(duì)比表(±s)

表2 各組對(duì)象生化及臨床指標(biāo)對(duì)比表(±s)

參數(shù) 研究組 健康組 F P TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)GGT(U/L)CHE(KU/L)CRP(mg/L)ESR(mm/h)46.4±13.8 24.9±9.8 66.3±12.7 81.2±26.7 332.1±123.5 102.9±18.9 6.8±4.1 4.1±2.1 14.2±8.9 16.6±5.3 4.3±2.6 30.7±4.6 36.2±6.2 77.3±16.5 23.4±7.8 7.3±4.0 4.6±1.6 13.7±7.8 8.7 10.6 9.8 8.8 22.2 36.4 4.8 5.3 5.1 0.012 0.001 0.003 0.031 0.029 0.017 0.124 0.063 0.057

2.2 miR-132和miR-212的表達(dá)水平 兩組患者的miR-132和miR-212的表達(dá)水平均有所降低，特別是miR-132降低幅度較大。而部分患者的miR-212水平出現(xiàn)了升高，但此部分患者占肝硬化患者的一小部分。也就是說，肝硬化患者的miR-132和miR-212均出現(xiàn)了波動(dòng)，miR-132以下降為主，下降幅度在50%以上，而miR-212除極少部分偏高外，絕大部分都出現(xiàn)了一定程度的下降。見表3。

表3 各組研究對(duì)象血清miR-132和miR-212的表達(dá)水平對(duì)比(x±s)

3 討論

目前普遍認(rèn)為miR-132是血管生長(zhǎng)的刺激因子，miR-132升高時(shí)，血管的修復(fù)能力增加，毛細(xì)血管更加發(fā)育。而當(dāng)miR-132下降時(shí)，機(jī)體的自我修復(fù)能力表現(xiàn)低迷，機(jī)體愈合能力降低。miR-132無疑為肌體特別是血管修復(fù)的“開關(guān)因子”。miR-212因子是刺激細(xì)胞分裂的因子，當(dāng)miR-212因子升高時(shí)，細(xì)胞分裂更加活躍，而當(dāng)miR-212因子降低時(shí)，細(xì)胞分裂活動(dòng)比較緩慢。事實(shí)上，目前的癌癥信息素治療方案中，有效地抑制miR-132和miR-212因子，可以有效地調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生和惡化的概率。而肝硬化患者體內(nèi)的miR-132降低抑制了肝臟的自我修復(fù)，而miR-212的波動(dòng)，引起了肝臟內(nèi)局部異常增生或者同步造成了肝臟的自我修復(fù)能力降低。

Selmi C等[1]對(duì)肝硬化的免疫功能改變進(jìn)行了研究，特別研究了肝硬化患者手術(shù)康復(fù)期的免疫能力變化。肝硬化患者的免疫力在本文研究中出現(xiàn)了普遍下降，比非肝硬化組出現(xiàn)炎性癥狀的概率明顯升高。Dai R等[9]研究了自身免疫對(duì)于源發(fā)膽汁肝硬化的病理作用。原發(fā)性膽汁性肝硬化是導(dǎo)致miR-212升高的主要原因，在原發(fā)性膽汁性肝硬化條件下，miR-132下降幅度更加明顯，而miR-212更傾向于發(fā)生升高的變化。Murata K等[10]研究了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨膜炎患者的miR-132和miR-212表達(dá)。miR-132與miR-212在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨膜炎患者血清中的表達(dá)與肝硬化類似，此兩類患者的miR-132和miR-212表達(dá)均出現(xiàn)了較明顯的下降，且miR212降低的幅度大于肝硬化患者。Wei X等[11]研究了病毒性肝癌患者的miR-132和miR-212表達(dá)。本文研究同步發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的miR-132和miR-212表達(dá)會(huì)出現(xiàn)顯著變化，miR212出現(xiàn)下降而miR-132在肝硬化體質(zhì)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)升高。這與肝硬化患者的免疫力下降是同步的。

Heathcote EJ等[12]對(duì)肝臟疾病進(jìn)行了統(tǒng)觀性的研究。徐蕓等及陳燕等對(duì)肝硬化患者的相關(guān)體征檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行了匯總，并且做出了統(tǒng)觀性研究[13，14]。 從某種意義上，miR-132 和 miR-212 表達(dá)是肝硬化患者的一個(gè)體質(zhì)特征，本文雖然沒有對(duì)miR-132和miR-212表達(dá)于肝硬化的形成產(chǎn)生明顯的相關(guān)性結(jié)論，但足以證明miR-132和miR-212表達(dá)與肝硬化體質(zhì)具有直接的關(guān)系。

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