韓珍，林日文，駱妙卡

(惠州市結(jié)核病防治研究所，廣東 惠州516008)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是可造成人類死亡的常見感染性疾病，是全球公共衛(wèi)生面臨的重大威脅[1]。近年來耐藥結(jié)核病的發(fā)病率不斷上升，耐藥結(jié)核病是結(jié)核病控制的難題。TB的早期特異性診斷和及時治療、及時切斷傳播鏈并保護易感人群對結(jié)核病的治療和預(yù)防具有重要意義[2]。細(xì)菌學(xué)早期診斷是結(jié)核病防治的關(guān)鍵，抗酸染色、羅氏固體培養(yǎng)等傳統(tǒng)TB診斷技術(shù)操作簡單、經(jīng)濟、方便，易于推廣，但也存在耗時長、敏感度和特異性差、難以標(biāo)準(zhǔn)化等不足，無法滿足臨床需求[3，4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，分子線性探針雜交技術(shù)檢測結(jié)核病的臨床應(yīng)用得以推廣[5]。然而目前國內(nèi)外關(guān)于分子線性探針技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的可靠性和及時性分析比較少。本研究比較MTBDR plus技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)診斷耐藥TB的結(jié)果。準(zhǔn)確性、敏感度、特異度、Kappa值及出報告所需時間，為耐藥TB的早期診斷方法的選擇提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 連續(xù)納入2014年1月至10月期間我院收治的246例涂陽肺結(jié)核患者作為研究對象。246例患者中男127例，女119例，年齡19~79歲，平均年齡(42.52±8.78)歲，患者均無其他呼吸系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重心肺肝腎功能障礙。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰標(biāo)本的收集 每例例涂陽肺結(jié)核患者均留取連續(xù)3d共3份痰標(biāo)本，將獲取標(biāo)本置于4℃冰箱中保存并于留取標(biāo)本3d內(nèi)完成耐藥情況的診斷。痰標(biāo)本的分離和培養(yǎng)均嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》的要求進(jìn)行。

1.2.2 傳統(tǒng)藥敏實驗 對分離出的菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種進(jìn)行鑒定并進(jìn)行異煙肼和利福平藥敏實驗，菌株鑒定采用對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行生長實驗。藥敏實驗參照WHO/IUATLD標(biāo)準(zhǔn)，菌株培養(yǎng)采用中和離心法，使用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落制成1mg/ml的懸液并梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種于含40μg/ml利福平和0.2μg/ml異煙肼的羅氏固體培養(yǎng)集中。將標(biāo)本置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為6周。培養(yǎng)完成后讀取菌落數(shù)并計算耐藥百分比，耐藥百分比低于1%為敏感，耐藥百分比高于1%為耐藥，同時出現(xiàn)異煙肼和利福平耐藥為耐多藥。實驗操作均嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會 《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》要求進(jìn)行，所用培養(yǎng)基均由Basco公司提供。

1.2.3 MTBDR plus線性探針技術(shù)檢測 每例患者均取1份陽性級別最高的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，檢測試劑盒為德國Hain Life Sciences公司的GenotypeRMTBDR plus試劑盒，具體操作步驟如下：將標(biāo)本進(jìn)行消化后制成重懸液，將500μl重懸液加入離心管內(nèi)5000r/min離心10min后去掉上清液并加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進(jìn)行渦旋震蕩后于95℃水中水浴5min，5000r/min離心 1min后去掉上清液再次加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進(jìn)行渦旋震蕩5s，再次5000r/min離心5min。取上清液5μl加入預(yù)先配置好的PCR擴增體系中，擴增循環(huán)為95℃擴增15min、95℃擴增30min、56℃擴增 3min，共 10個循環(huán)；然后 95℃擴增 25s、53℃擴增 40s、70℃擴增 40s，共20個循環(huán)；最后 70℃擴增8min。擴增完成后將產(chǎn)物與探針試紙條進(jìn)行雜交，根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥性的判讀。

1.2.4 傳統(tǒng)核酸擴增技術(shù)檢測 檢測方法參照參考文獻(xiàn)[6]，將痰標(biāo)本進(jìn)行去污處理，取0.5μl痰標(biāo)本提取DNA模版進(jìn)行擴增加后進(jìn)行耐藥性分析。

1.3 線性雜交技術(shù)結(jié)果判讀 試紙條共27個反應(yīng)條帶和4各區(qū)域，第1區(qū)為對照質(zhì)控帶，其他區(qū)為耐藥相關(guān)基因探針區(qū)，其中第2區(qū)是利福平耐藥相關(guān)rpoB基因探針區(qū)，第3、4區(qū)分別為與異煙肼耐藥相關(guān)的KatG、inhA基因探針區(qū)，野生條帶均顯色而突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶缺失和突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，采用敏感度和特異度對檢測結(jié)果的真實性進(jìn)行評價，采用準(zhǔn)確性對檢測方法的應(yīng)用價值進(jìn)行評價，采用Kappa值分析MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實驗方法檢測結(jié)果的一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)檢測結(jié)果比較 MTBDR plus技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實驗檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。核酸擴增檢測技術(shù)檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率則均低于傳統(tǒng)藥敏實驗檢測所得結(jié)果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)檢測結(jié)果比較[n(%)]

2.2 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的準(zhǔn)確性比較 與核酸擴增檢測技術(shù)比較，MTBDR plus技術(shù)檢測利福平耐藥、異煙肼耐藥和耐多藥的敏感度、Kappa值均較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、表3和表4。

表2 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)診斷利福平耐藥的準(zhǔn)確性比較

表3 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)診斷異煙肼耐藥的準(zhǔn)確性比較

表4 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)診斷耐多藥的準(zhǔn)確性比較

2.3 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴增檢測技術(shù)出報告時間比較 MTBDR plus技術(shù)出報告時間0.5~2d，平均出報告時間為(1.26±0.58)d，核酸擴增出報告時間 4~15d，平均出報告時間為(8.89±1.08)d，MTBDR plus技術(shù)出報告時間顯著短于核酸擴增檢測技術(shù)出報告時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=13.82，P<0.01)。

3 討論

近年來我國耐藥結(jié)核病的發(fā)病率不斷上升，作為全球27個耐藥結(jié)核病高發(fā)國家之一，我國初診結(jié)核病患者中約5%的患者為耐藥結(jié)核病患者，而復(fù)發(fā)結(jié)核病患者中約1/4的患者為耐藥結(jié)核病患者[7，8]。目前地市級醫(yī)院由于實驗室診斷能力落后，結(jié)核耐藥診斷報告往往需數(shù)月時間，耐藥診斷結(jié)果的滯后性可明顯影響治療效果，耐藥結(jié)核患者無法得到及時有效的治療且耐藥結(jié)核病的傳播無法得以控制[9,10]。傳統(tǒng)耐藥檢測耗時長且靈敏性和特異性均較低，無法滿足耐藥結(jié)核病早期準(zhǔn)確診斷的需求[11]。線性探針技術(shù)可通過對耐藥相關(guān)基因的PCR擴增和反向雜交確定結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性，報告可于24h內(nèi)獲得，具有快速準(zhǔn)確的特點[12,13]。國外研究表明，線性探針技術(shù)用于涂陽痰標(biāo)本檢測的敏感度和特異度均較高[14]。2008年世界衛(wèi)生組織亦推薦線性探針技術(shù)可應(yīng)用于低收入國家耐藥結(jié)核病的診斷[15]。然而目前國內(nèi)關(guān)于線性探針技術(shù)診斷結(jié)合耐藥性的可靠性和及時性的研究報道甚少。明確線性探針雜交技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)檢測耐藥結(jié)核病的準(zhǔn)確度和所需時間可為耐藥結(jié)核病的早期診斷和疾病的控制提供指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，分子線性探針雜交技術(shù)檢測所得利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的發(fā)病率與傳統(tǒng)藥敏檢測結(jié)果相近，而傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)檢測所得分子利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的發(fā)病率低于分子線性探針雜交技術(shù)和傳統(tǒng)藥敏實驗檢測結(jié)果。傳統(tǒng)基因檢測診斷利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的特異性和準(zhǔn)確性均較高，說明傳統(tǒng)基因檢測在耐藥結(jié)核病的診斷中具有一定價值，然而其敏感度和Kappa值均較低，傳統(tǒng)基因檢測在耐藥結(jié)核病檢測中的準(zhǔn)確性有待提高。而分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病的敏感度、特異性、準(zhǔn)確性及Kappa值均較高，分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病具有較好的可靠性。分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病出報告的時間短，可于2d內(nèi)給出耐藥結(jié)核病診斷報告，而傳統(tǒng)基因檢測耗時長，出報告時間需約10d，分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病具有較高的及時性。線性探針雜交技術(shù)可通過異煙肼和利福平等耐藥相關(guān)基因的檢測來完成耐藥結(jié)核分枝桿菌的檢測，有助于耐藥TB的早期診斷和及時治療。由于實驗室檢測受操作人員水平、環(huán)境等多方面因素的影響，因此明確線性探針技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)在結(jié)核病診斷中的可靠性和及時性需進(jìn)一步全面深入研究。

綜上所述，分子線性探針技術(shù)較傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)可更及時、準(zhǔn)確地診斷耐藥結(jié)核病，同時具有較高的可靠性，是耐藥結(jié)核病診斷的有效方法。

[1]陸偉,周揚,陳誠,等.江蘇省社區(qū)人群結(jié)核桿菌耐藥狀況及影響因素研究[J].中華疾病控制雜志,2013,17(7):560-563.

[2]何麗,雷英,吳芳,等.結(jié)核桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)與耐藥結(jié)核桿菌耐藥性的相關(guān)性研究 [J].中國免疫學(xué)雜志,2014,(11):1441-1447,1451.

[3]Ezati N,Lukoye D,Wampande EM,et al.The Mycobacterium tuberculosis Uganda II family and resistance to first-line anti-tuberculosis drugs in Uganda[J].BMC Infect Dis,2014,14(1):703.

[4]魏存樂,王岐,王志剛.223例結(jié)核分枝桿菌耐藥分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(9):2222-2224.

[5]時金艷,李鐵成,夏榮榮,等.線性探針技術(shù)用于快速篩查耐多藥結(jié)核病的研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(4):330-333.

[6]Gholoobi A,Masoudi-Kazemabad A,Meshkat M,et al.Comparison of Culture and PCR Methods for Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in Different Clinical Specimens[J].Jundishapur J Microbiol,2014,7(2):e8939.

[7]花春玲,孫曉穗,平靜珍,等.結(jié)核分枝桿菌的耐藥性研究[J].中國消毒學(xué)雜志,2013,30(7):626-627.

[8]李琦,張逸彪,雷敏,等.2008-2011年結(jié)核分枝桿菌的耐藥性變遷[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2013,23(19):4841-4843.

[9]杜增蘭,王岐,王峰,等.253株人型結(jié)核分枝桿菌耐藥性分析[J].內(nèi)科,2012,07(4):370-372.

[10]江淵,趙麗麗,桂曉虹,等.MGIT960系統(tǒng)快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的應(yīng)用評價[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2013,30(3):202-204.

[11]孫炳奇,張娟,孫秀華,等.MGIT960法和絕對濃度法對耐多藥結(jié)核桿菌藥敏檢測比對分析[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,(12):1877-1879.

[12]Imperiale BR,Di Giulio AB,Adrián Cataldi A,et al.Evaluation of Mycobacterium tuberculosis cross-resistance to isoniazid,rifampicin and levofloxacin with their respective structural analogs[J].J Antibiot(Tokyo),2014,67(11):749-754.

[13]梁建琴,李洪敏,高華方,等.應(yīng)用PCR-熒光探針法快速檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因型 [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2013,23(21):5140-5142.

[14]Palomino JC,Vandamme P,Martin A.Classical and new assays for detecting drug resistance in tuberculosis[J].Biomark Med,2014,8(9):1105-1014.

[15]Ali IF,Babak F,Fazlollah MS,et al.Rapid detection of MDR-Mycobacterium tuberculosis using modified PCR-SSCP from clinical Specimens[J].Asian Pac J Trop Biomed,2014,4(Suppl 1):S165-170.