林麗華 ，吳秀珍 ，黃紹娥 ，卓德祥 ，涂文瑞

(1、福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建三明365000；2、三明市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建三明365000)

膀胱癌有非浸潤(rùn)性膀胱癌和浸潤(rùn)性膀胱癌兩種類型。這兩種類型的膀胱癌有著不同的分子改變，并且臨床預(yù)后也不相同[1]。前者發(fā)病率較高，約占膀胱癌患者總數(shù)的70%，對(duì)生命威脅較小，但卻因易復(fù)發(fā)需要定期復(fù)查，對(duì)患者造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；浸潤(rùn)性膀胱癌發(fā)病率較低，占臨床上膀胱癌總數(shù)的30%，但其往往更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致不良的臨床后果[2]。為深入研究膀胱癌在分子水平的改變，我們用基因芯片分析兩種類型膀胱癌的基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白 1(complete S transactivated protein 1，CSTP1)[3]在膀胱癌組織表達(dá)較癌旁組織明顯降低,信息學(xué)分析顯示CSTP1 mRNA編碼一個(gè)分子量36kDa的蛋白磷酸酶催化亞單位結(jié)構(gòu)域(protein phosphatase 2A catalytic unit，PP2Ac)。 為進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，我們用RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 RT-PCR 提取膀胱癌及癌旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，上下游引物：5'-ACA TCC ACT CAA ACG CTC ACC-3'和5'-ACA CAT GGG GAT TAT GGG GAT-3'，擴(kuò)增 CSTP1 基因(140bp)。

1.2 抗體制備 合成IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA多肽抗原，將多肽抗原與完全弗氏佐劑充分混合乳化后進(jìn)行首次皮下、皮內(nèi)多點(diǎn)注射。將不完全弗氏佐劑與抗原混合，于第14、24、35d進(jìn)行加強(qiáng)免疫。末次加強(qiáng)免疫后6d耳緣靜脈取血進(jìn)行抗體特異性測(cè)定。末次取血后5d心臟取血，分離血清并親和層析純化。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建 RT-PCR法擴(kuò)增CSTP1基因ORF全長(zhǎng)(引物 1：5'-AA GGA TCC AAC TCG CTC GCC ATG TCG-3'; 引物 2：5'-AA GAA TTC CTT TTT TCT TGA TCA AAT CCA TGA GAT C-3'),克隆入pGEM-T-easy質(zhì)粒，雙向測(cè)序正確后亞克隆入pcDNA3.1myc/his C質(zhì)粒，所得質(zhì)粒命名為pcDNA3.1myc/his C-CSTP1。

1.4 蛋白免疫印跡 pcDNA3.1myc/his C-CSTP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，48h后，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量。80V電壓電泳，200mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5h,脫脂牛奶室溫封閉1h，加1:2000稀釋的兔抗CSTP1多克隆抗體，4℃孵育過夜，第2天，TBST洗滌3次，加二抗。TBST洗3次后顯色、曝光。

1.5 免疫組化染色 甲醛固定后石蠟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、分級(jí)酒精水化后，3%過氧化氫室溫封閉內(nèi)源性過氧化酶活性15min，在10mmol/L EDTA(pH 8.0)中高壓熱修復(fù)3min，兔抗CSTP1抗體(1:200)4℃孵育過夜,EnVision兩步法系統(tǒng)檢測(cè)CSTP1的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CSTP1 mRNA在膀胱癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)我們用RT-PCR方法檢測(cè)CSTP1 mRNA在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示，CSTP1 mRNA在膀胱癌組織表達(dá)較來源于同一病人的癌旁組織明顯降低。見圖1。

圖1 CSTP1 mRNA在膀胱癌組織中表達(dá)明顯降低

2.2 多克隆抗體制備及鑒定 DNA star軟件分析CSTP1的蛋白氨基酸序列顯示，CSTP1蛋白第213氨基酸至第232氨基酸之間的多肽(IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA)具有良好的抗原性、疏水性并可能位于蛋白表面，適合于作為制備多克隆抗體的免疫原。我們將此多肽合成并與KLH連接后形成所需抗原，與完全弗氏佐劑充分混合乳化后進(jìn)行皮下、皮內(nèi)多點(diǎn)注射新西蘭大白兔，將不完全弗氏佐劑與抗原混合，充分乳化后于第14、24、35d進(jìn)行加強(qiáng)免疫。末次加強(qiáng)免疫后6d耳緣靜脈取血進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)。末次取血后5d心臟取血，分離抗血清并親和層析純化。為檢測(cè)制備的多克隆抗體的特異性，我們把pcDNA3.1myc/his CCSTP1及對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)CSTP1蛋白的表達(dá)。Western結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1myc/his CCSTP1質(zhì)粒組細(xì)胞在36kDa分子量處有一特異信號(hào)帶，該結(jié)果驗(yàn)證了制備的多克隆抗體具有良好的特異性。見圖2。

圖2 293T細(xì)胞中CSTP1蛋白表達(dá)

2.3 免疫組化分析CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá) 基因的表達(dá)調(diào)控具多水平性，mRNA表達(dá)減少并不一定代表執(zhí)行功能的蛋白質(zhì)的表達(dá)降低，我們用制備的多克隆抗體檢測(cè)CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示，CSTP1蛋白產(chǎn)物在非浸潤(rùn)性膀胱癌及浸潤(rùn)性膀胱中表達(dá)均較癌旁組織明顯降低。見圖3。

圖3 CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)

3 討論

蛋白磷酸酶催化已經(jīng)磷酸化蛋白質(zhì)發(fā)生去磷酸化，并進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白分子的生物活性，其與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同調(diào)節(jié)磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機(jī)制。目前研究人員至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多種蛋白激酶，如Akt[4-6]、Ras[7，8]、BRAF[9,10]、PIM-1[11,12]等 ， 并 且 對(duì) 蛋 白 激 酶 的 功能，尤其在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用進(jìn)行了深入的研究，但對(duì)于去磷酸化的磷酸酶，研究人員的認(rèn)識(shí)不論從種類還是其功能都很膚淺。有研究顯示,在人類腫瘤中蛋白磷酸酶往往具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的特性,如PTEN[13,14],PP2A[15]等。我們前期基因芯片結(jié)果顯示CSTP1在膀胱癌組織表達(dá)較癌旁組織明顯降低,信息學(xué)分析顯示CSTP1 mRNA編碼一個(gè)分子量36kDa的PP2Ac。

然而，基因芯片雖然具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，卻存在著假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。為了驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可靠性，我們用RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，膀胱癌組織CSTP1基因在mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)均較癌旁組織明顯降低，提示CSTP1可能是一個(gè)抑癌基因，其低表達(dá)可能參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程。

在本研究中，我們用RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)了CSTP1在膀胱癌組織中的表達(dá)，成功制備了兔抗CSTP1多克隆抗體，為進(jìn)一步研究CSTP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、周期、凋亡的影響及其分子機(jī)制鋪墊了基礎(chǔ)。

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