聶志文，梁振山，曾令兵

(1、上海市第一人民醫(yī)院寶山分院檢驗科，上海200940；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006；3、南昌大學第一附屬醫(yī)院，江西 南昌330006)

鉤端螺旋體病(簡稱“鉤體病”)是世界范圍內(nèi)流行的人獸共患病[1-3]。鉤體病的臨床癥狀輕重、緩急不一，輕癥患者可只表現(xiàn)為感冒樣癥狀；而重癥患者則可出現(xiàn)肝、腎、肺等多臟器的出血性病變，甚至死亡[4]。目前，鉤體病的關鍵致病因子還未完全闡明[5]。本研究在前期分泌蛋白質(zhì)組的基礎上，對其中篩選得到的問號鉤體外分泌蛋白的致病功能進行研究，為進一步闡明問號鉤體的致病因子及致病機制提供必要的依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因組 由上海交通大學病原生物學教研室提供問號鉤體56601株的基因組。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 克隆菌株為E.coli DH5α，表達宿主為E.coli Bl21(DE3)，均購于天根生物有限公司。表達載體為pET28a(+)由上海交通大學病原生物學教研室饋贈。

1.1.3 試劑 KOD-plus購于TOYOBO公司。限制性內(nèi)切酶及連接酶Solution I，購于TAKARA公司。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購于Promega公司。蛋白至分子量標準購自Fermentas公司。其他試劑均為進口分裝。

1.1.4 問號鉤體感染兔血清 該血清由上海交通大學病原生物學教研室饋贈。由問號鉤體強毒株56601株，經(jīng)耳緣靜脈注射感染新西蘭兔制備獲得。

1.1.5 培養(yǎng)基 配制LB培養(yǎng)基：1%NaCl，1%胰蛋白胨以及0.5%酵母浸出液，百分比為質(zhì)量體積比。1.1.6引物 由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 四個鉤體外分泌蛋白表達載體的構(gòu)建 PCR反應條件如下，預變性：95℃ 2min；擴增步驟：95℃變性 1min；55℃退火 30s；68℃延伸 1~2min(延伸時間由產(chǎn)物大小決定)；進行35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR引物見表1。

表1 鉤體外分泌蛋白重組克隆引物

1.2.2 獲得的PCR產(chǎn)物在相應的限制性內(nèi)切酶作用后，在連接酶Solution I的作用下，與pET28a(+)連接，最終得到攜帶有目的基因的表達載體。隨后，將相應的表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主E.coli Bl21(DE3)中，進行后續(xù)的表達純化過程。四個鉤體外分泌重組蛋白的表達和純化

將構(gòu)建完成的表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主E.coli Bl21(DE3)中，在卡那霉素抗性(100μg/ml)平板中過夜生長，挑選陽性克隆于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按1：100擴大培養(yǎng)。并于37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至OD值在0.8~1.0左右，將培養(yǎng)瓶移至25℃培養(yǎng)箱中，200r/min振蕩培養(yǎng)。30min后，加入0.1mM IPTG過夜誘導表達。第二天，10，000r/min棄去上清液，收集菌體。 菌體加入 30ml NTA-0(150mM NaCl，50mM Tris HCl pH8.0，咪唑濃度為0mM)并充分混勻重懸，于超聲破碎儀中充分破碎菌體至清亮(功率為200~300W)，約5min。超聲破碎后，將混合液于離心機中>13,000r/min離心大于20min，棄去上清。沉淀物用NTA-0及8M脲素，充分溶解。未能溶解部分，于離心機中>13,000rpm離心20min去除。同時，Ni2+中加入NTA-0-8M脲素，室溫平衡20min。平衡后，將脲素溶解的蛋白加入到Ni2+中，隨后以不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，進行SDS-PAGE，收集在目的分子量位置，條帶單一相應管的蛋白。最后，將收集好的蛋白進行透析及超濾濃縮至500μl左右，并測定蛋白濃度。

1.2.3 四個鉤體外分泌重組蛋白的Western Blot重組純化后得到的鉤體外分泌蛋白先進行SDS PAGE電泳，后以100V恒定電壓，電轉(zhuǎn)1h，將SDS PAGE膠上的蛋白，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉 1h，TBST(TBS，0.05%吐溫-20)洗膜3次，每次5min。然后，將膜與準備好的1:3000稀釋的組氨酸標記單克隆抗體 (anti-His)，或問號鉤體56601株感染兔血清于4℃反應過夜。用TBST洗膜3次，每次5min；再與1:5000辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(或兔)IgG室溫反應30min，后以發(fā)光底物(Thermo Scientific Pierce ECL Plus Substrate)顯色。

1.2.4 鉤體外分泌蛋白體外黏附功能驗證 將Fibronectin、Laminin、Collagen I、Collagen IV、BSA 等介質(zhì)包被在在96孔板中 (未包被孔作為空白對照)，4℃包被過夜；封閉(無蛋白封閉緩沖液，Thermo Scientific)；加入 1μg 目的蛋白，37℃作用 3h；棄去反應液，PBST充分洗滌5遍，并拍干；加入Anti-His HRP(1:2，000)100μl；37℃反應 1h； 棄去反應液，PBST充分洗滌5遍，并拍干；加入100μl混合好的A、B顯色液，常溫顯色15min；終止顯色；加入50μl 1MH2SO4，終止顯色反應；450nm 中測定其OD值。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 在前期問號鉤體56601株外分泌蛋白質(zhì)組的基礎上，篩選得到四個可能與問號鉤體致病相關的蛋白-LA_2413、LA_2823、LA_3469 和 LB_194，其表達情況見圖1A。與56601株感染兔血清的Western Blot見圖1B。

2.2 問號鉤體56601株重組外分泌蛋白與ECMs的黏附作用，見圖2及圖3。結(jié)果顯示，LA_3469與LA_2413能夠與Laminin、Collagen I和 Collagen IV有黏附作用；而LA_3469還能夠與Fibronectin有黏附作用[14,15]。

3 討論

鉤體病是一種世界范圍內(nèi)流行的人獸共患病，其在77個國家已有報道，尤以水稻種植為主的廣大發(fā)展中國家，更為盛行。我國也是鉤體病的高發(fā)地區(qū)之一，主要集中在降水量相對充足的長江中下游地區(qū)，如江西省、湖北省、四川省等省份[5]。自80年代后，我國鉤體病的發(fā)病率雖然處于逐年下降的趨勢，但是鉤體病疫區(qū)常常隨著洪水季節(jié)的到來而出現(xiàn)爆發(fā)。然而，鉤體病的致病機制及關鍵致病因子，卻未被完全闡明。并且，近年來的研究主要集中在鉤體的外膜蛋白上[7-9]，關于鉤體的分泌蛋白質(zhì)組卻鮮有報道。直至2013年，由本研究組成員首先報道了問號鉤體56601株的分泌蛋白質(zhì)組。該研究采用無蛋白培養(yǎng)基C-70，不同于鉤體的常用培養(yǎng)基EMJH和Korthof。C-70中不含有或含有微量的蛋白成分，這不僅利于富集鉤體的分泌蛋白，而且還可以避免培養(yǎng)基中的其他蛋白成分對后期的質(zhì)譜檢測造成不必要的影響。關于鉤體的無蛋白或低蛋白培養(yǎng)基，已有學者在1978年進行了報道。該類培養(yǎng)基旨在獲得鉤體疫苗菌株，應用于鉤體病的預防。隨后，我國的鉤體病研究學者根據(jù)該類培養(yǎng)基的特性，對鉤體無蛋白培養(yǎng)基進行了改良，最終獲得C-70培養(yǎng)基。而C-70培養(yǎng)基也同樣應用在制備鉤體疫苗當中。本研究的前期工作，首先評估了鉤體無蛋白培養(yǎng)基C-70對強毒株問號鉤體56601株的生長、形態(tài)以及毒力的影響。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，C-70培養(yǎng)獲得的鉤體，其形態(tài)及生長狀況，與EMJH培養(yǎng)鉤體相比，并未出現(xiàn)顯著性差異。此外，C-70培養(yǎng)鉤體也保持了其感染金黃地鼠的能力[6]。隨后，我們借助56601株的全基因組及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，對問號鉤體的分泌系統(tǒng)做了較為系統(tǒng)的分析，最終發(fā)現(xiàn)，問號鉤體具備了部分分泌系統(tǒng)的關鍵元件，而尤以I、II型分泌系統(tǒng)相對完整[10]。在此基礎上，我們鑒定并分析了56601株的分泌蛋白質(zhì)組。隨后，我們通過鉤體感染金黃地鼠模型，比較了鑒定得到的鉤體分泌蛋白在體內(nèi)外的表達差異。最終，我們發(fā)現(xiàn)，有兩個蛋白在體內(nèi)下調(diào)表達，有15個蛋白上調(diào)表達。而在上調(diào)表達的蛋白中，有8個蛋白為脂蛋白。既往的研究表明，脂蛋白不僅是鉤體的重要組成成分(如LipL32等)，也是重要的致病因子，同樣，其也是非常重要的鉤體病診斷和疫苗的候選靶標。本研究在此基礎上，對篩選得到的8個脂蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)其中有4個蛋白已經(jīng)被研究，而另外 4 個 脂 蛋 白 (LA_2413、LA_2823、LA_3469 和LB_194)功能并未有相關報道。因此，本研究對這四個脂蛋白的體外致病功能進行了初步的分析，為進一步篩選新的鉤體致病因子提供一定的依據(jù)。

圖1 問號鉤體56601株外分泌蛋白體外重組表達

圖2 問號鉤體56601株重組外分泌蛋白與不同細胞外基質(zhì)的黏附作用

圖3 LA_3469在不同濃度下與不同介質(zhì)的黏附作用

細胞外基質(zhì)(extracelular matrix，ECM)，是由動物細胞合成并分泌到細胞外，分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。這些物質(zhì)能夠構(gòu)成復雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，對于防御病原菌的入侵有著非常重要的作用。前期的研究表明，鉤體的部分表面暴露蛋白(主要是外膜蛋白)，能夠與宿主的細胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，并以此發(fā)揮一定的致病功能[7,11,12]。與此同時，致病性鉤體主要是通過破損的皮膚入侵并感染人體的，而細胞外基質(zhì)是構(gòu)成該屏障的主要組成成分。因此，本研究首先體外重組表達了這四個問號鉤體外分泌蛋白，獲得了純化的體外重組蛋白。通過體外黏附實 驗 ， 研 究 LA_3469、LA_2413、LA_2823 以 及LB_194與不同細胞外基質(zhì)的黏附功能，最終發(fā)現(xiàn)，LA_3469與LA_2413能夠與細胞外基質(zhì)Laminin、Collagen I以及Collagen IV發(fā)生黏附作用，LA_3469還能夠與Fibronectin發(fā)生黏附作用。Cao等的蛋白質(zhì)組結(jié)果中顯示，LA_3469在37oC時表達量上調(diào)，這也進一步提示LA_3469是鉤體的一個重要的致病因子[13]。

本研究在前期問號鉤體外分泌蛋白質(zhì)組的基礎上，對篩選得到的體內(nèi)外表達存在差異的外分泌脂蛋白進行了體外的功能實驗。這為篩選鉤體的關鍵致病因子及闡明鉤體病的致病機制提供了新思路。

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