薛曉婕 程勇

PSA、TNF?α及Bax?α在前列腺癌中的表達

薛曉婕 程勇

目的 探討前列腺特異性抗原（PSA）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）及B細胞淋巴瘤基因?2相關(guān)x蛋白（Bax?α）與前列腺癌的關(guān)系。 方法 選取前列腺癌患者30例（Ⅰ期12例、Ⅱ期8例、Ⅲ期5例、Ⅳ期5例），正常對照20例，采用電化學(xué)發(fā)光儀檢測患者空腹PSA，放射免疫法測定TNF?α，免疫組織化學(xué)SP法檢測Bax?α蛋白的表達，分析Bax?α的表達與前列腺癌組織臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。 結(jié)果 前列腺癌中Bax?α的陽性率高于正常組織（P＜0.01），前列腺癌患者的臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Bax?α的陽性率越高（P＜0.01）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者PSA水平以及Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的TNF?α水平均明顯高于正常對照者。 結(jié)論 Bax?α在細胞凋亡調(diào)節(jié)中起著重要的作用，其過度表達在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。聯(lián)合檢測Bax?α、PSA和TNF?α水平的變化對前列腺癌的診斷、治療和預(yù)后判斷均具有一定的臨床價值。

前列腺癌；前列腺特異性抗原；腫瘤壞死因子α；B細胞淋巴瘤基因?2相關(guān)x蛋白

由男性重要的性腺器官前列腺引起的疾病在不同的年齡階段有不同的特點，老年人多為前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）及前列腺癌（prostate cancer，PCa）。隨著年齡的增加，PCa的發(fā)病率呈明顯增加的趨勢，PCa是男性泌尿生殖系最常見的腫瘤。應(yīng)用前列腺特異抗原（prostatic specific antigen，PSA）進行大規(guī)模PCa篩查，是目前早期診斷PCa的最有效方法，但其對PCa的早期診斷仍有一定困難和偏差，容易漏診。分子生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)證明PCa的發(fā)生和發(fā)展是多種癌基因和抑癌基因共同作用的結(jié)果，本研究通過聯(lián)合檢測PSA和TNF?α的濃度以及Bax? α蛋白的表達，探討3者在PCa的發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為臨床診斷提供更多的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集黃石市中心醫(yī)院病理科2010～2013年經(jīng)明確診斷的PCa患者30例，年齡50～70歲，平均（54.9±0.27）歲，收集全部組織標本?；颊咝g(shù)前均未行放療、化療及生物治療；按國際抗癌聯(lián)盟2010年TNM分期標準進行臨床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期8例、Ⅲ期5例、Ⅳ期5例。同期收集有組織學(xué)標本的正常對照20例，家族無腫瘤病史，所有組織液氦保存。

1.2 血標本采集方法 無抗凝的采血管采集肘靜脈全血4 ml，室溫靜置1 h凝固，然后4℃、2000 r／min離心10 min，取出上層血清，分裝于聚丙烯EP管中，置－80℃冰箱保存待測。

1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清購自Gibco公司；鼠抗人Bax?α單克隆抗體購自日本MBL公司；羊抗鼠IgG／HRP購自美國Proteintech Group公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自德國Roche公司。

1.4 細胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，用于檢測Bax?α蛋白的表達。

1.5 指標檢測方法

1.5.1 血清PSA測定：使用德國羅氏P800全自動生化分析儀檢測患者血清中的PSA，采用電化學(xué)發(fā)光方法，標本均為同批測定，以上檢測均受控于衛(wèi)生部臨檢中心、湖北省臨檢中心的室間質(zhì)評。

1.5.2 血清TNF?α檢測：采用放射免疫分析方法，試劑盒由廈門新創(chuàng)生物科技有限公司提供，操作按說明書。

1.5.3 Bax?α蛋白檢測：采用鏈霉菌抗生物素蛋白?過氧化酶連接（SP）免疫組織化學(xué)方法。每例標本解凍后經(jīng)10%甲醛固定24 h內(nèi)行石蠟包埋，石蠟包埋組織后4 μm連續(xù)切取切片，常規(guī)脫蠟水化，PBS沖洗。高溫修復(fù)抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗2次，3 min／次，滴加一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗，滴加生物素標記的二抗。室溫下孵育15 min，PBS沖洗，聯(lián)苯二胺（DAB）顯色5 min，蘇木索復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6 Bax?α蛋白結(jié)果判定 在組織切片中顯示胞核或胞漿染為淡黃至黃棕色者為陽性細胞標志。凡顯色強度與背景無明顯差別者為陰性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有結(jié)果均取自1次代表性實驗，結(jié)果被3次獨立實驗所證實。所測數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bax?α的表達與PCa患者臨床病理特征的關(guān)系Bax?α表達陽性染色主要定位于腫瘤細胞胞漿中，為粗細不一的棕黃色顆粒。正常前列腺組織中Bax?α基因表達微弱；Ⅰ期12例PCa組織標本中，1例Bax?α的表達呈陽性，占8.33%。Ⅱ期8例中4例Bax?α的表達呈陽性，占50%。Ⅲ期、Ⅳ期標本中Bax?α的表達均為強陽性，隨PCa臨床分期的增加，Bax?α陽性率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人Bax?α陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 PCa患者臨床病理特征與Bax?α表達的關(guān)系（n，%）

2.2 正常人和PCa患者血清PSA和TNF?α含量比較

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者PSA含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者TNF?α含量也高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表2 正常對照組和PCa患者血清PSA和TNF?α含量比較（ˉx±s）

3 討論

PSA是由前列腺上皮細胞分泌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，直接分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)，它的正常功能是幫助精液凝塊水解液化，與男性生育功能有關(guān)［1］。正常的前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)周圍存在血?上皮屏障，能避免前列腺上皮產(chǎn)生的PSA直接進入血液之中，從而維持了血液中PSA的低濃度。一般認為，血清PSA濃度＜4 ng／ml為正常，＞10 ng／ml則患PCa的危險性增加。當前列腺發(fā)生癌變時可破壞血?上皮屏障，同時癌細胞分泌的PSA增多，致使更多的PSA直接進入血液內(nèi)［2］。目前臨床用于PCa診斷最廣泛的分子標志物是PSA，在臨床上已將其作為PCa的一個重要的篩查指標［3］。大多數(shù)PCa病人血清PSA水平超過正常值，已成為重要的PCa腫瘤標記物，目前具有很好的PCa診斷預(yù)測率，有助于低分級、小病灶的早期發(fā)現(xiàn)與診斷。但它并不是一個特異性的腫瘤標記物，當其濃度在4～10 μg／L時存在一定比例的假陰性、假陽性的病例［4］。TNF?α是激活的單核巨噬細胞及脂肪細胞分泌的一種細胞因子，研究表明，敗血癥、惡性腫瘤、心力衰竭和慢性炎性疾病患者血清TNF?α水平升高。Bcl?2是細胞凋亡過程中的一類調(diào)節(jié)因子，此基因家族包含2類功能相反的基因，一類是抑制細胞凋亡的基因Bcl?2、Bcl?XL、Bcl?w、Bfl?1、Brag?1、Mcl?1和A1等，另一類是促進細胞凋亡的基因Bax、Bak、Bok、Bcl?Xs、Bad、Bid、Bik、Blk和Hrk等。Bax?α過表達可促進細胞色素C的釋放，使正常細胞原癌基因激活，受病毒感染的機會增加，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化；另外也延緩了腫瘤細胞凋亡，增加惡性細胞數(shù)量［5］。

本研究將不同分化程度的PCa患者血清中PSA、TNF?α的含量和Bax?α蛋白的表達與正常對照者的血清聯(lián)合進行比較，結(jié)果顯示PCa（Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）患者血清PSA、TNF?α和Bax?α蛋白表達均顯著高于正常對照組，但當PCa在Ⅰ期時，按照血清PSA濃度＜4 ng／ml為正常時，僅僅通過檢測PSA含量難以將其與正常對照組區(qū)分開，PSA用于檢測PCa缺乏特異性。因此，同時將PSA、TNF?α和Bax?α蛋白進行聯(lián)合檢測，可明顯提高對PCa診斷的準確性，提高了PCa診斷的靈敏度和特異性，減少病人不必要的活檢，為PCa疾病診斷、治療、預(yù)后觀察提供臨床價值。

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Expression of Bax?α，PSA and TNF?α in prostate cancer

XUE Xiao?jie．
Department of Clinical Laboratory，Huangshi Central Hospital，Huangshi 435000，China；CHENG Yong．Huangshi Center for Disease Control，Huangshi 435000，China

Objective To explore the relationship between prostatic specific antigen（PSA），tumor necrosis factor?α（TNF?α），Bax?α and prostate cancer. Methods The serum PSA levels were detected by electro?chemiluminescence，TNF?α examined by RIA，and immunohisto?chemical method was used to detect the expression of Bax?α in the prostate cancer tissue of 30 cases and 20 healthy persons. Results The expression of Bax?α in the patients with prostate cancer was significantly higher than that in healthy persons（P＜0.01）.The expression of Bax?α was related with clinical stage，me?tastasis in lymph node in prostatic patients（P＜0.01）.The concentration of TNF?α in stageⅠ、Ⅱ、ⅢandⅣand PSA in stageⅠ、Ⅱ、ⅢandⅣpatients was significantly higher than that in control group（P＜0.05 or P＜0.01）. Conclusions Bax?α is correlated with the modulation of proliferation in the development of prostate cancer.The over?expression of Bax?α plays an important role in the development of prostate cancer.Detection of serum PSA，TNF?α and Bax?α level shows clini?cal value for diagnosis，treatment and prognosis prediction of prostate cancer.

prostate cancer；prostatic specific antigen；TNF?α；Bax?α

R 737.25

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.03.012

2014?02?26）

435000湖北省黃石市，黃石市中心醫(yī)院檢驗科（薛曉婕）；435000湖北省黃石市，黃石市疾病預(yù)防控制中心（程勇）

程勇，Email：715309678＠qq.com