倪杰 蔣輝 張龍 張均 房宇

淫羊藿苷對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響

倪杰 蔣輝 張龍 張均 房宇

目的 探討淫羊藿苷對體外培養(yǎng)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的數(shù)量及相關(guān)功能的影響。 方法 采用密度梯度離心法分離出人外周血的EPCs，將淫羊藿苷加入相應(yīng)培養(yǎng)基，并根據(jù)加入培養(yǎng)基中淫羊藿苷的濃度0、10、20、50 μmol／L分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。然后檢測各組EPCs數(shù)量及功能的變化并進行比較。 結(jié)果 淫羊藿苷干預(yù)組的外周血EPCs的數(shù)量以及增殖、遷移、黏附能力和血管生成能力與對照組相比均有明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且其中高劑量組（50 μmol／L）效果最為顯著（P＜0.05）。 結(jié)論 淫羊藿苷能明顯增加人外周血EPCs的數(shù)量并改善EPCs的增殖、黏附、遷移以及血管生成能力等相關(guān)功能。

淫羊藿苷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞功能

內(nèi)皮細(xì)胞的前體內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial pro?genitor cells，EPCs）是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的祖細(xì)胞，也是血管形成的前體細(xì)胞，在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程中起著非常重要的作用［1?4］。淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要活性成分，屬于黃酮醇苷類化合物，具有增強免疫功能、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種藥理學(xué)作用，是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點中藥單體成分之一［5］，但其對人外周血內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響尚未見報道。本研究采用人外周血分離培養(yǎng)出EPCs，予淫羊藿苷進行干預(yù)，檢測其增殖、分化、黏附、遷移及血管生成能力等功能變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 淫羊藿苷（純度＞98%）（南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所）；M199培養(yǎng)基（Introvigen公司）；胎牛血清（杭州四季青生物）；淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD34小鼠抗人單克隆IgG1抗體（eBioscience公司）；別藻藍蛋白（APC）標(biāo)記的AC133小鼠抗人單克隆IgG1抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的KDR小鼠抗人單克隆IgG1抗體、FITC標(biāo)記的小鼠IgG1抗體、APC標(biāo)記的小鼠IgG1抗體、PE標(biāo)記的小鼠IgG1抗體（eBioscience公司）；噻唑蘭（MTT）（Sigma公司）；人纖維連接蛋白（Chemicon）；Dil標(biāo)記的乙酞化低密度脂蛋白（Dil?acLDL）（Invitrogen公司）；FITC標(biāo)記荊豆凝集素I（FITC?UEA?I）（USbiological公司）；體外血管生成試劑盒（Chemicon公司）。

1.2 儀器 倒置相差顯微鏡（奧林巴斯）；多波長激光共聚焦顯微鏡（萊卡）；全自動酶標(biāo)儀（ThermoLab?system）；流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinsonand Company）；改良的Boyden小室（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定［6］：將20%胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）12 μg／L、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）4 μg／L、青霉素100 U／ml、鏈霉素100 U／ml加入M199培養(yǎng)基中，通過健康成人肘靜脈抽取外周血10 ml，應(yīng)用密度梯度離心法分離出單核細(xì)胞，重懸于上述培養(yǎng)基中，以2×106密度接種于提前24 h預(yù)先包被有人纖維連接蛋白（Fn，5 μg／cm2）的細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%二氧化碳（CO2）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，收集貼壁細(xì)胞并更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。收集貼壁細(xì)胞供實驗用。細(xì)胞與Dil?acLDL及FITC?UEA?I孵育后，激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs；流式細(xì)胞儀檢測EPCs表面抗原標(biāo)志，分析CD34、CD133和KDR的陽性表達百分率。

1.3.2 實驗分組：培養(yǎng)7 d后鑒定為EPCs的細(xì)胞用于研究，按照不同濃度淫羊藿苷干預(yù)的細(xì)胞分為對照組、低劑量組（10 μmol／L）、中劑量組（20 μmol／L）、高劑量組（50 μmol／L）。培養(yǎng)48 h后進行細(xì)胞功能檢測。

1.3.3 細(xì)胞集落、梭形細(xì)胞計數(shù)：用光學(xué)顯微鏡計數(shù)15個隨機視野（×200倍）的梭形細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目。培養(yǎng)48 h后，用光學(xué)顯微鏡計數(shù)15個隨機視野（×200倍）細(xì)胞集落數(shù)。

1.3.4 EPCs黏附能力測定：用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500 μl培養(yǎng)液并計數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs鋪在24孔板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，計數(shù)貼壁細(xì)胞。不同濃度淫羊藿苷共培養(yǎng)48 h后，將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37℃下培養(yǎng)30 min，計數(shù)15個隨機200倍視野中貼壁細(xì)胞［7］。

1.3.5 EPCs遷移能力檢測：將200 μl培養(yǎng)液和50 ng／ml的VEGF 20 μl加入改良的Boyden小室的下室，將2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞懸浮在100 μl培養(yǎng)液注入上室，在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)6 h，取出微孔濾膜，PBS漂洗，以無水乙醇固定，Harris蘇木精染色，在37℃溫度下烤膜過夜，無水乙醇脫水，二甲苯透明濾膜。對遷移到低層的細(xì)胞進行計數(shù)，選擇3個隨機顯微鏡視野（× 400倍）進行計數(shù)［7］。

1.3.6 EPCs增殖能力的檢測：將各組處理后的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。以每孔100 μl接種于已包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個復(fù)孔和空白對照。按MTT試劑盒操作步驟，用全自動酶標(biāo)儀按參比波長為490 nm，測定各孔吸收光密度（OD）值［7］。

1.3.7 體外成血管能力分析：按照體外血管生成試劑盒操作，在24孔板中每孔分別放入300 μl基質(zhì)膠，37℃下孵育30 min，不同分組的細(xì)胞懸液（5×104）取300 μl加入24孔板，孵育24 h，在200倍倒置顯微鏡下觀察體外血管生成情況。隨機選擇5個顯微鏡視野（×200）計數(shù)小管數(shù)量［7］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 14.0軟件進行分析，2組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)及形態(tài)觀察 培養(yǎng)第4天可見大量圓形單核細(xì)胞核少量梭形內(nèi)皮樣細(xì)胞（×40）；培養(yǎng)第7天可見大量梭形內(nèi)皮樣細(xì)胞聚集成集落（×40），見圖1（封二）。

2.2 細(xì)胞熒光染色鑒定 用Dil?acLDL和FITC?UEA?I對細(xì)胞染色后，通過激光共聚焦顯微鏡鑒定。能對Dil?acLDL攝取（激光共聚焦顯微鏡下呈紅色，激發(fā)波長543 nm）和與FITC?UEA?I結(jié)合（呈綠色，激發(fā)波長477 nm）進行鑒定。Dil?acLDL和FITC?UEA?I雙染色陽性細(xì)胞（呈黃色）被認(rèn)為是正在分化的EPCs，見圖2（封二）。

2.3 EPCs表面抗原標(biāo)志的鑒定 外周血獲取的單個核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，其中表達CD133為（17.89±4.27）%，CD34為（30.29±5.45）%，KDR為（71.59±5.36）%，進一步證明獲得的細(xì)胞為EPCs。

2.4 細(xì)胞數(shù)量和功能檢測結(jié)果 按照不同濃度淫羊藿苷干預(yù)的EPCs培養(yǎng)48 h后進行細(xì)胞數(shù)量和功能檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，3種不同劑量淫羊藿苷干預(yù)組的EPCs的數(shù)量以及其增殖、遷移、粘附、血管形成能力（小管數(shù)量）均有明顯提高（P＜0.05），并且與低劑量組相比，高劑量組的干預(yù)效果更為明顯（P＜0.05）。見表1。

表1 不同劑量淫羊藿苷對體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量及功能的影響（ˉx±s，n＝5）

3 討論

全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病目前已成為人類死亡病因中名副其實的頭號殺手，并且在發(fā)展中國家這一趨勢更加明顯。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是心腦血管病變和動脈粥樣硬化等各種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的始動因素，也是多種疾病累及心腦血管系統(tǒng)的最終結(jié)果［8?10］。心腦血管疾病的危險因素可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并觸發(fā)前炎性細(xì)胞因子級聯(lián)系統(tǒng)，導(dǎo)致單核細(xì)胞聚集和平滑肌細(xì)胞增生，致使動脈粥樣化斑塊形成。因此，保持血管內(nèi)皮層的完整和功能活性，在對抗動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。EPCs在體內(nèi)外均能定向分化為成熟的EPCs，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有修復(fù)和保護能力，促進新血管的生成。因此改善EPCs的數(shù)量和功能對于治療心腦血管疾病具有重要的意義。

淫羊藿別名仙靈牌，是中國傳統(tǒng)的補益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕之功效，李時珍在《本草綱目》中稱其有“益精氣，堅筋骨，補腰膝，強心力”之功效［11］?，F(xiàn)代藥理實驗表明，淫羊藿有效成分為淫羊藿苷，其具有廣泛的生理活性。據(jù)文獻報道以淫羊藿苷為主要成分的制劑對心腦血管系統(tǒng)、骨代謝、免疫系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理功效［12］。

本研究通過人外周血分離培養(yǎng)出EPCs，并通過Dil?acLDL及FITC?UEA?I雙染色以及流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志的方法成功鑒定，并且根據(jù)國外研究報道以CD34、CD133、KDR這3種表面標(biāo)志物陽性來定義EPCs可以更好地減少異質(zhì)性［13?14］，以此來進一步證實為EPCs。并應(yīng)用不同濃度淫羊藿苷對其進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的淫羊藿苷均可增加體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量，能夠改善EPCs的數(shù)量以及增殖、粘附、遷移、體外血管生成等細(xì)胞功能，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），并且其作用效果在高劑量時最明顯，呈一定的劑量依賴性。但是淫羊藿苷如何動員EPCs的內(nèi)在機制尚不明確，需要進一步的實驗研究探索。總之，本研究結(jié)果表明淫羊藿苷能夠通過提高外周血EPCs數(shù)量及功能來改善和修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，可能對心腦血管疾病能夠起到一定的保護和治療作用，也為以后進一步進行體內(nèi)試驗提供了良好的試驗基礎(chǔ)。

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Effect of icariin on the numbers and the function of endothelial progenitor cells from human peripheral blood

NI Jie，ZHANG Long，ZHANG Jun，F(xiàn)ANG Yu．
Department of Emergency，Nanjing Drum Tower Hospital，Nanjing 210008；JIANG Hui．Department of Neurology，Jiangsu Province Hospital of TCM，Nanjing 210029，China

Objective To explore the effects of icariin on the numbers and the function of endothelial progenitor cells（EPCs）isolated from peripheral blood in human. Methods EPCs were isolated from peripheral blood of human by the method of density gradient centrifugation.According to the icariin concentration（0，10，20，50 μmol／L）added to culture medium，they were divided into control group，low dose group，middle dose group and high dose group respectively. Those groups were incubated for 48 hours，then the number of EPCs and their impact on cell function were observed. Re?sults Compared with control group，it was observed in icariin treatment group that the number of EPCs in peripheral blood and the ability of adhesion，migration，proliferation and angiogenesis in vitro increased obviously（P＜0.05），and high dose group（50 μmol／L）was the most significant. Conclusions Icariin can significantly increase the number of EPCs in hu?man peripheral blood，and improve its capabilities of proliferation，adhesion，migration and angiogenesis.

icariin；endothelial progenitor cells；cell function

R 329.28

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.03.011

2014?05?30）

210008江蘇省南京市，南京市鼓樓醫(yī)院急診科（倪杰，張龍，張均，房宇）；210029江蘇省南京市，江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)科（蔣輝）

房宇，Email：fhho526＠163.com