徐曉臣 趙冉冉 徐飛 路志民 李建社 檀國軍

·論 著·

α?硫辛酸對(duì)EAE大鼠的保護(hù)作用和機(jī)制探討

徐曉臣 趙冉冉 徐飛 路志民 李建社 檀國軍

目的 研究α?硫辛酸（alpha?lipoic acid，ALA）在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）大鼠模型中對(duì)脊髓組織的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。 方法 Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（NC組）、EAE組（EAE組）和α?硫辛酸組（ALA組）。對(duì)照組不接受任何處理，EAE組接受免疫注射，ALA組在EAE組基礎(chǔ)上加用ALA治療。采用Kono評(píng)分法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)估，在實(shí)驗(yàn)60 d時(shí)取材，觀察脊髓腰膨大段組織的病理學(xué)改變，以免疫組化方法標(biāo)記白介素?17（IL?17），觀察其表達(dá)變化，分光光度計(jì)檢測(cè)腦組織中還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。 結(jié)果 EAE組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，ALA組大鼠神經(jīng)功能明顯改善（P＜0.05）；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，EAE組大鼠脊髓腰膨大炎癥標(biāo)記物IL?17蛋白的表達(dá)比NC組明顯增加（P＜0.05）；ALA治療后IL?17蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與NC組相比，EAE組大鼠腦組織中GSH含量明顯下降（P＜0.05），MDA含量明顯增加（P＜0.05），ALA治療后顯著增加了GSH含量（P＜0.05），降低了MDA含量（P＜0.05）。 結(jié)論 ALA可能是通過抑制炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激發(fā)揮了在EAE大鼠模型中的保護(hù)作用。

多發(fā)性硬化；α?硫辛酸；炎癥；氧化應(yīng)激

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）及其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥及脫髓鞘改變?yōu)樘卣鞯募膊?。近年來研究發(fā)現(xiàn)α?硫辛酸（alpha?lipoic acid，ALA）在EAE模型中具有保護(hù)作用［1］，但其機(jī)制還不明確，國外研究發(fā)現(xiàn)ALA有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖從而抑制自身免疫的作用［2］。本研究觀察ALA在EAE大鼠中的保護(hù)作用及其對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激的影響，探討其機(jī)制，為臨床EAE的診治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性Wistar大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g；清潔級(jí)雌雄不限豚鼠3只，體質(zhì)量350～400 g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 ALA（美國Sigma公司），佐劑用卡介苗（北京生物制品研究所），兔抗多克隆抗體IL?17（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），丙二醛（MDA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：石蠟切片機(jī)（德國萊卡RM2015），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS BX51T?PHD?J11）。

1.3 動(dòng)物模型的建立 將健康豚鼠3只用水合氯醛350 mg／kg麻醉后，迅速取脊髓全長(zhǎng)，去除脊膜并稱重，按脊髓質(zhì)量與冰鹽水體積1∶10制成豚鼠脊髓勻漿，再與等量含6 mg／ml卡介苗的完全福氏佐劑充分混合，冰上抽打制成油包水乳劑，為完全免疫抗原。按0.5 ml／只分別于大鼠四肢足墊及背部皮下注射抗原勻漿，建立EAE大鼠模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將Wistar大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（NC組）不接受任何處理，EAE組注射免疫抗原，ALA組在EAE基礎(chǔ)上接受ALA治療，各組10只。ALA組自第1次發(fā)病起給予藥物腹腔注射，按100 mg／（kg· d）連續(xù)注射60 d。

1.5 IL?17免疫組化、MDA和GSH檢測(cè) 在免疫第60天時(shí)動(dòng)物麻醉后，冰上迅速取脊髓腰膨大段組織和腦組織。每組取3只進(jìn)行脊髓腰膨大段組織多聚甲醛固定，常規(guī)切片，行IL?17染色。另外每組7只腦組織液氮速凍后－80℃保存，用于檢測(cè)MDA和GSH含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 Kono評(píng)分方法 動(dòng)物尾部無力為1分，尾部無力伴雙前肢或雙后肢無力為2分，雙前肢或雙后肢癱瘓為3分，四肢癱瘓被動(dòng)翻身不能復(fù)原為4分，瀕死狀態(tài)或死亡為5分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用ˉx±s表示。組間比較采用方差分析，2組之間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠發(fā)病和神經(jīng)功能缺損情況 在抗原免疫后，大鼠出現(xiàn)精神萎靡、皮毛光澤下降、體質(zhì)量減輕等變化，于免疫后第11天起陸續(xù)出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為尾部張力下降、尾部無力，逐漸出現(xiàn)四肢麻痹、大小便失禁等變化。20只免疫的大鼠中共有16只發(fā)病。

自免疫開始每天對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，共記錄20 d，并對(duì)各組大鼠的平均每日神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行比較。NC組大鼠平均每日神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0；EAE組為1.65±0.11，與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ALA組為0.51±0.02，與EAE組相比，ALA顯著緩解了EAE模型大鼠神經(jīng)功能障礙（P＜0.05）。

2.2 脊髓腰膨大組織IL?17表達(dá)的變化 各組脊髓腰膨大前角IL?17免疫染色的AOD值分別為：NC組0.23±0.01，EAE組0.48±0.02，ALA組0.33±0.01。3組大鼠脊髓前角IL?17蛋白的表達(dá)存在明顯差異（P＜0.05），見圖1。EAE組IL?17蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組增加108%，ALA治療后IL?17蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），表現(xiàn)為ALA組IL?17蛋白免疫反應(yīng)強(qiáng)度的AOD值比EAE組降低32%（P＜0.05）。

2.3 腦組織GSH和MDA含量的改變 與NC組相比，EAE組大鼠腦組織中GSH含量明顯下降（P＜0.05），MDA明顯升高（P＜0.05）；ALA組與EAE組相比，GSH含量明顯增加（P＜0.05），MDA水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠脊髓IL?17 AOD值（n＝3）

表1 ALA對(duì)腦組織中MDA和GSH含量的影響（ˉx±s，n＝7）

3 討論

EAE模型很好地模擬了MS的病理過程，其神經(jīng)功能評(píng)分、組織病理學(xué)、特異性T細(xì)胞增殖及其炎性細(xì)胞因子的反應(yīng)等方面符合MS的發(fā)病［3］，廣泛應(yīng)用于MS的實(shí)驗(yàn)研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥參與了MS的發(fā)展過程，抗氧化應(yīng)激治療有可能是治療MS的有效策略。

ALA是一種強(qiáng)抗氧化劑，主要通過清除自由基和活性氧、螯合金屬離子、再生其他內(nèi)源性抗氧化劑而發(fā)揮其抗氧化作用［6］，作為神經(jīng)保護(hù)劑已被應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的防治［7］。ALA能夠改善2型糖尿病患者周圍神經(jīng)病變［8］，對(duì)局麻藥物布比卡因引起的小鼠神經(jīng)損害也有保護(hù)效應(yīng)［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)，EAE組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損，模型建立成功，免疫組化發(fā)現(xiàn)脊髓腰骶膨大處的前角細(xì)胞有IL?17蛋白表達(dá)明顯升高，腦組織中MDA含量增高，GSH含量下降；ALA可改善神經(jīng)功能，降低IL?17的表達(dá)，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，升高機(jī)體抗氧化物GSH的含量。表明在EAE大鼠模型中，ALA具有緩解EAE臨床癥狀、抑制IL?17表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激的作用。

MS的發(fā)病有多種機(jī)制參與，目前尚無定論。目前認(rèn)為IL?17在MS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，IL?17／IL?23軸是MS最重要的治療靶點(diǎn)。IL?17是一種前炎性細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化、生物因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，IL?17在MS患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)數(shù)量高于健康對(duì)照組，且表達(dá)水平增高與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)［4］，應(yīng)用抑制IL?17活性的藥物能夠減輕EAE病情嚴(yán)重程度［5］。有研究報(bào)道，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中，ALA能夠抑制IL?17的表達(dá)，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)［10］。結(jié)合本研究中ALA組大鼠臨床癥狀改善、IL?17表達(dá)下降，ALA在EAE大鼠中有可能是通過下調(diào)IL?17、減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。

近年來研究表明，MS發(fā)病過程不僅有炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激也參與了MS的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧自由基生成超過了機(jī)體處理氧自由基的能力，過多的氧自由基對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)膜、DNA等結(jié)構(gòu)造成損傷，造成細(xì)胞功能異常甚至死亡。研究認(rèn)為MS的炎癥環(huán)境將導(dǎo)致氧自由基的生成增加和氧化應(yīng)激的生成，從而進(jìn)一步促進(jìn)了MS的進(jìn)展和惡化［11］。炎癥可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激反過來也可以促進(jìn)炎癥，二者形成了惡性循環(huán)。作為強(qiáng)效抗氧化劑，ALA對(duì)EAE大鼠的保護(hù)作用，也有可能是通過減輕氧化應(yīng)激，繼而減輕炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，ALA有可能通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮了對(duì)EAE大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，本研究為闡明MS的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of alpha?lipoic acid on experimental allergic encephalomyelitis rats and related mechanisms

XU Xiao?chen，LI Jian?she．Department of Neurology；XU Fei，LU Zhi?min．
Department of Urology，the First Hospital of Handan，Handan 056002，China；ZHAO Ran?ran，TAN Guo?jun．Department of Neurology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050071，China

Objective To explore the effects of alpha?lipoic acid（ALA）on experimental allergic encephalomy?elitis（EAE）and the possible mechanisms. Methods Female Wistar rats were randomly divided into three groups：normal control group（NC group），EAE model group（EAE group），and the ALA administrated EAE model group（ALA group）.Kono scale was used to evaluate neurofunction deficiency.Immunohistochemistry was used to detect the expression of IL?17 in the spinal cord on the 60th day of the disease course.Spectrophotometry was used to detect the levels of malondialdehyde（MDA）and glutathione（GSH）in the brain. Results In EAE group，the score of Kono scale was significantly higher（P＜0.05），the expression of IL?17 significantly increased，MDA significantly increased（P＜0.05），and GSH significantly decreased（P＜0.05）.However，ALA could effectively improve neurofunction（P＜0.05），decrease the expression of IL?17（P＜0.05），decrease the level of MDA（P＜0.05），and increase the level of GSH（P＜0.05）. Conclusions ALA may exert its neuroprotective effect through ameliorating inflammative reacts and oxidative stress.

mutiple sclerosis；alpha?lipoic acid；inflammation；oxidative stress

R 593.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.03.006

2014?08?11）

河北省科技廳課題（11276425）；河北省重點(diǎn)科技計(jì)劃（20090371）

056002河北省邯鄲市，邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（徐曉臣，李建社），泌尿科（徐飛，路志民）；050071河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（趙冉冉，檀國軍）

檀國軍，Email：ecg001＠sohu.com