劉 波，李世龍，尤建宇，陳文忠，于 濤

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033）

探討miRNA表達(dá)比在多發(fā)性骨髓瘤中的預(yù)測作用

劉 波，李世龍，尤建宇，陳文忠，于 濤＊

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033）

目的探討miRNA（微小RNA）表達(dá)比在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中的預(yù)測作用。方法收集24例MM患者及30例正常對照的血漿標(biāo)本，運(yùn)用高通量芯片的方法將差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選；對分析結(jié)果進(jìn)行qRT－PCR驗(yàn)證；用ROC曲線分析了miRNA表達(dá)比，找出最具預(yù)測潛能的組合型標(biāo)志物。結(jié)果與正常血漿標(biāo)本相比，基因芯片檢測出178個(gè)差異表達(dá)的miRNA，選取其中4個(gè)miRNAs在24例MM血漿標(biāo)本和30例正常血漿標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。其中miR－21在多發(fā)性骨髓瘤中比在正常人中有明顯的高表達(dá)，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p在多發(fā)性骨髓瘤中則是低表達(dá)；miR－21／miR－199a－5p的表達(dá)比表現(xiàn)出很高的靈敏度和特異度，可以作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的組合型生物標(biāo)志物。結(jié)論miR－21／miR－199a－5p表達(dá)比或許可以成為預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤的生物標(biāo)志物。

微小RNA；多發(fā)性骨髓瘤；生物學(xué)標(biāo)記

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0259）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為骨髓惡性漿細(xì)胞異常增生的血液系統(tǒng)惡性疾病，其發(fā)病率僅次于白血病，居血液系統(tǒng)惡性疾病的第二位。盡管治療策略已從化療、自體造血干細(xì)胞移植演變?yōu)榘邢蛩幬镏委煟沟枚喟l(fā)性骨髓瘤的預(yù)后得到了顯著的改善，但多發(fā)性骨髓瘤仍是不可治愈的腫瘤之一。諸多研究已經(jīng)表明，miRNA廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后［1］，很可能是一類潛在的癌基因［2，3］或抑癌基因［4］，亦可以作為診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物［5，6］。本研究旨在檢測miRNA表達(dá)比在多發(fā)性骨髓瘤血漿中的預(yù)測作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

24例多發(fā)性骨髓瘤血漿標(biāo)本來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血液內(nèi)科，30例健康對照組血液標(biāo)本來自吉大中日聯(lián)誼醫(yī)院門診非惡性血液病病人的血漿標(biāo)本，空腹抽取靜脈血4ml，用含EDTA抗凝劑的采血管采集。所有患者均符合張之南等主編的《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》（1998年）中提出的MM診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效標(biāo)準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要材料和試劑

RNA提取所需TRLzol reagent以及電泳所需瓊脂糖購自Invitrogen（美國）公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT－PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒均購自蘇州吉瑪公司?；虮磉_(dá)譜芯片及miRNA芯片為Illumina芯片（美國）。三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自天津化學(xué)試劑公司，DEPC處理水購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

將裂解血按照TRLzol reagent（Invitrogen）說明書進(jìn)行RNA抽提，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20℃保存.

1.4 芯片制備

將制備好血漿cDNA與雜交試劑混合，加入GEX－HBY和RNA－FREE水進(jìn)行雜交。樣本經(jīng)過室溫孵育、洗滌、干燥后，進(jìn)行掃描及分析。

1.5 分析方法

使用lllumina BeadChip Reader對芯片進(jìn)行讀取并獲取圖像，用lllumina BeadStudio Application分析數(shù)據(jù)。以正常血漿組為對照組，多發(fā)性骨髓瘤血漿組為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組相對于對照組的差異表達(dá)作為差異miRNA。

1.6 qRT－PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA

用熒光定量PCR儀（Stratagene MX3000P日本）對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，U6作為內(nèi)參。hsamiR－21引物序列：UAGCUUAUCAGACUGA UGUUGA。hsa－miR－199a－5p引物序列：CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。hsa－miR－16引物序列：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。hsa－miR－125a－5p引物序列：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性20 s，60℃退火延伸30s，50個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。ROC曲線采用MedCalc軟件。芯片數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多發(fā)性骨髓瘤血漿標(biāo)本中miRNA的差異表達(dá)

與正常血漿標(biāo)本相比，在多發(fā)性骨髓瘤血漿標(biāo)本中共有178個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)的62個(gè)，下調(diào)的116個(gè)（P＜0.05），見表1。

表1 基因芯片中miRNA的差異表達(dá)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證4個(gè)差異表達(dá)的miRNA

實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示miR－21表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢（P＜0.05），而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p則表現(xiàn)出顯著的下調(diào)趨勢（P＜0.05），本結(jié)果與芯片結(jié)果一致，見圖1。

2.3 miRNA表達(dá)比的篩選

為了確定miRNA表達(dá)比在多發(fā)性骨髓瘤中的預(yù)測價(jià)值，采用Gordon等［5］的方法，將唯一上調(diào)的miR－21和3個(gè)下調(diào)的miRNA做比值，用ROC（受試者工作特征曲線）來確定哪組表達(dá)比具有最大的預(yù)測潛力（圖2）。發(fā)現(xiàn)miR－21／miR－199a－5p具有96%的靈敏度和100%的特異度（P＜0.05），而miR－21／miR－16的靈敏度和特異度均較差，miR－21／miR－125a－5p的特異度較差（表2）。后兩者均不適合作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的腫瘤標(biāo)志物。

圖1 四個(gè)差異表達(dá)的miRNA

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種源發(fā)于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤。目前多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制不清，治療效果不理想。因此尋找預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤標(biāo)志物極具有臨床推廣價(jià)值。許多研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)并對疾病的預(yù)后有預(yù)測價(jià)值［7－9］。

表2 三種miRNA表達(dá)比的靈敏度和特異度

圖2 3種miRNA表達(dá)比的ROC曲線圖

本研究對收集的多發(fā)性骨髓瘤血漿標(biāo)本進(jìn)行miRNA芯片檢測，發(fā)現(xiàn)了共有178個(gè)差異表達(dá)的miRNA。miR－21表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p則表現(xiàn)出顯著的下調(diào)趨勢。在24個(gè)多發(fā)性骨髓瘤血漿標(biāo)本里進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示與芯片結(jié)果趨勢一致，從而進(jìn)一步證實(shí)了miRNA做為多發(fā)性骨髓瘤診斷的生物標(biāo)志物的可能性。Michele等［10］證實(shí)頭頸部腫瘤中的miR－221／miR－375表達(dá)比具有93%的特異度和92%的靈敏度，故可作為頭頸部腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于明確了多發(fā)性骨髓瘤患者的miRNA表達(dá)變化，將一個(gè)上調(diào)的miRNA和三個(gè)下調(diào)的miRNA做比值，用受試者工作特征曲線來確定哪些miRNA表達(dá)比能具有預(yù)測價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明miR－21／miR－199a－5p具有96%的靈敏度和100%的特異度。與單純的miRNA表達(dá)變化相比，miRNA表達(dá)比具有更強(qiáng)大的預(yù)測能力，更小的誤診率和漏診率。

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Studies on the roles of miRNA expression forecast in multiple myeloma

LIU Bo，LI Shi－long，YOU Jian－yu et al.（De－

partment of Orthopedics，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveWe sought to identify microRNA altered in multiple myelomaand determine that microRNA ratio is an predictive tool for multiple myeloma.MethodsThe plasma of MM patients and 30normal controls were choosed and cofirmed，Respectively.The miRNA expression profiles were examined with Illumina Bead Chips.The results were verified by qRT－PCR.The miRNA expression ratio was analysed by ROC curve，aiming to find the most predictive potential of combination－type markers.Results178miRNAs were found to be significantly deregulated in the plasma of 24MM patients and 30normal controls plasma samples.miR－21were significantly higher than in normal plasma sample，while miR－199a－5p，miR－16and miR－125a－5p showed low expression；Furthermore，the ratio of miR－21／miR－199a－5p showed a high sensitivity and specificity for disease predicition.ConclusionThese results indicate that miR－21／miR－199a－5p ratio could be used as diagnostic biomarker in multiple myeloma.

MicroRNA；multiple myeloma.；Biological Marker

R733.3

A

2014－02－23）

1007－4287（2015）02－0259－03

＊通訊作者