邵國(guó)喜，焦晶雪，劉欽毅，程兆華，李偉民

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林長(zhǎng)春130041）

聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯／GDNF導(dǎo)管對(duì)大鼠脊髓損傷區(qū)GAP－43mRNA表達(dá)的影響

邵國(guó)喜，焦晶雪，劉欽毅＊，程兆華，李偉民

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林長(zhǎng)春130041）

目的探討PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管對(duì)脊髓損傷功能恢復(fù)的影響。方法我們采用RT－PCR的方法對(duì)GAP－43的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，從基因水平上來檢測(cè)植入PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管與其他治療組GAP－43基因表達(dá)上的差異。結(jié)果術(shù)后第2周時(shí)，A組、B組、C組和D組的GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平與正常組相比明顯增高；術(shù)后4周時(shí)，B組和D組的GAP43mRNA表達(dá)與第2周時(shí)相比明顯增高，與A組和C組相比明顯增高，有顯著性差異；術(shù)后6周時(shí)，D組的GAP－43mRNA表達(dá)仍明顯增高，與A組、B組和C組相比增高有顯著性差異；第8周時(shí)各組GAP－43mRNA表達(dá)均有所下降，但D組的GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平與A組、B組和C組相比仍高，有顯著性差異。結(jié)論P(yáng)LA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管更有利于軸突再生的修復(fù)連接和脊髓損傷的功能恢復(fù)。

脊髓損傷；聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯；GAP－43mRNA；導(dǎo)管移植

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0198）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織再生更具有挑戰(zhàn)性，目前的治療方法大都不能有效的充分恢復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)功能。為此我們研究聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯（PLA－PTMC）聯(lián)合GDNF的復(fù)合導(dǎo)管對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組

健康Wistar雌性大鼠，體重220－260g，隨機(jī)分成為：正常對(duì)照組、完全脊髓橫斷組（A組）和治療組，治療組又按治療方法的不同分為3組，即單一應(yīng)用GDNF組（B組），單一應(yīng)用PLA－PTMC導(dǎo)管植入組（C組），應(yīng)用PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管植入組（D組）。每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物9只，實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物模型出現(xiàn)死亡，分析原因并改正，及時(shí)補(bǔ)充，并做標(biāo)計(jì)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)延時(shí)完成各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)估。

1.2 PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管的制備

稱取適量PLA－PTMC溶于乙酸乙酯中，加入GDNF凍干粉，超聲分散法充分混勻。制成每根導(dǎo)管含GDNF 400U的PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管數(shù)根。

PLA－PTMC導(dǎo)管由濟(jì)南健寶開元生物材料有限公司研究中心提供。GDNF由RD公司提供。

1.3 PCR引物

GAP－43引物根據(jù)GenBank所載大鼠GAP43的mRNA序列解設(shè)計(jì)，兩條引物序列分別為：上游為5′－AGGGAGATGGCTCTGCTACT－3′，下游5′TCTTTACCCTCATCCTGTCG3′?；驍U(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為406bp。

β－actin引物序列為上游：5′GAAATCGTGCGTGACATTAA3′，下游：5′CTAGAAGCATTTGCGGTGCA3′?；驍U(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為511 bp。

以上引物均由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 將大鼠用10%水合氯醛（0.25ml／100g體重）腹腔注射麻醉，腰背手術(shù)區(qū)3.0cm×1.5cm剃毛，常規(guī)碘氟消毒，按肋骨確定椎體序列，縱向剪開皮膚，切口長(zhǎng)約2.5cm。分離深筋膜及椎旁肌，顯露出T9－T11錐體的椎板和棘突，直至關(guān)節(jié)突，用蚊式止血鉗小心去除其棘突、椎板至關(guān)節(jié)突內(nèi)側(cè)面，暴露出脊髓硬脊膜，切開硬脊膜，用眼科剪橫斷脊髓，負(fù)壓吸引出少許斷端脊髓組織，使脊髓斷端形成4 mm間隙，確保完全斷裂。A組造模后直接關(guān)閉創(chuàng)口。B組脊髓完全橫斷后將裝入GDNF的微型泵安置于皮下，此泵通過聚乙烯導(dǎo)管直接導(dǎo)入脊髓離斷處，應(yīng)用微型泵泵入GDNF溶液（2mg／ml），0.5 μl／h，持續(xù)3周。C組于脊髓損傷區(qū)移植PLA－PTMC導(dǎo)管。D組于脊髓損傷區(qū)移植PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管，導(dǎo)管由切口下端向上端植入脊髓斷端間，用10－0無損傷線縫合硬脊膜。明膠海綿完全止血后，局部撒青霉素粉末2×105U，逐層縫合肌肉、深筋膜、皮膚，再次消毒。各組橋接方法完全相同。術(shù)后實(shí)行分籠飼養(yǎng)。正常對(duì)照組，不經(jīng)手術(shù)處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.2 半定量RT－PCR按試劑盒說明操作。取1 μl提取的RNA原液加299μl三蒸水，充分混勻，以三蒸水調(diào)零，紫外分光光度記檢測(cè)各組標(biāo)本RNA在260nm、280nm處的光吸收值，按下列公式計(jì)算RNA的濃度及純度。

RNA的濃度：RNA（μg／μl）＝OD260×40×300（稀釋倍數(shù)）×1000

RNA純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：OD260／OD280＝1.8－2.0。定量后，取各組標(biāo)本的總RNA各1μl在1%的瓊脂糖凝膠以90V電壓做穩(wěn)壓電泳，通過檢測(cè)28S及18SRNA的亮度比值也對(duì)所提取的垂體的總RNA做完整度的檢測(cè)。

1.4.3 RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定與定量分析 取20μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，0.5%溴化乙錠染色20min。用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)（EDAS）進(jìn)行電泳結(jié)果的拍照及電泳條帶的強(qiáng)度分析，分別計(jì)算各組樣品的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參照β－actin擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度比值來表示該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（ˉx±s）表示，采用LSD（Leastsignificant difference）法進(jìn)行兩兩間比較。由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

提取的RNA做1.0%的瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，28S和18SrRNA的兩條帶均明顯可見，且28S和18SrRNA兩條帶的強(qiáng)度之比大約為2，說明RNA完整性好，降解很少。

圖1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

2.2 各組大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析

各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓損傷區(qū)及正常對(duì)照組脊髓GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較見表1。術(shù)后第2周時(shí)，A組、B組、C組和D組的GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平與正常組相比明顯增高，P＜0.05，A組、B組、C組和D組各組間GAP－43的mRNA相對(duì)表達(dá)水平無顯著性差異；術(shù)后4周時(shí)，B組和D組的GAP43mRNA表達(dá)與第2周時(shí)相比明顯增高，P＜0.05，與A組和C組相比明顯增高，有顯著性差異，P＜0.05；術(shù)后6周時(shí)，D組的GAP－43mRNA表達(dá)仍明顯增高，與第4周時(shí)相比明顯增高，P＜0.05，與A組、B組和C組相比增高有顯著性差異，P＜0.05；第8周時(shí)各組GAP－43mRNA表達(dá)均有所下降，但D組的GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平與A組、B組和C組相比仍高，有顯著性差異，P＜0.05（見圖2）。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓損傷區(qū)及正常對(duì)照組脊髓GAP－43mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（n＝3，ˉx±s）

圖2 各組大鼠脊髓組織中GAP－43及β－actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

組織工程學(xué)中一種普遍的方法是模擬天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。在所有研究中，都出現(xiàn)了生物合成物，盡管沒有徹底的改變合成聚合物支架的降解速率和機(jī)械行為，但其對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖與神經(jīng)元延伸方面很有重要意義。這些材料同樣可在生物體外應(yīng)用于促進(jìn)神經(jīng)再生。制成人造移植物可以使其理化特性更適合于臨床應(yīng)用。PLA－PTMC能進(jìn)行生物降解，并且不會(huì)引起排斥反應(yīng)，還可以減少免疫反應(yīng)的發(fā)生。為了更好的了解其在脊髓損傷修復(fù)機(jī)制，了解修復(fù)過程中脊髓組織分子水平的變化是很必要的，在此我們集中關(guān)注GAP－43，因其在脊髓損傷修復(fù)中多次被提及，其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展、軸突再生、突觸功能的形成起很重要的作用，其表達(dá)的顯著與否用量化來描述，基于此目的我們采用RT－PCR法觀察各組大鼠脊髓損傷區(qū)其量化的變化［1－3］。GAP－43是一種磷酸蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是神經(jīng)再生的相關(guān)蛋白質(zhì)和關(guān)鍵因子，具有促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)發(fā)芽和突觸連接形成作用，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生長(zhǎng)及創(chuàng)傷修復(fù)過程中可發(fā)揮重要作用。其是神經(jīng)組織特有的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白，廣泛分布于神經(jīng)元、部分胚胎、再生的雪旺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)細(xì)胞中又以生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維末端含量豐富［4］。它與軸突的生長(zhǎng)密切相關(guān)。在神經(jīng)元發(fā)育和再生中，是神經(jīng)重塑和再生標(biāo)志，最具有代表性，應(yīng)用普遍［5］。它以快速軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的方式從胞體到未梢，在生長(zhǎng)過程中GAP－43選擇性表達(dá)，它的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)和合成在軸突再生和突觸再生時(shí)高度的表達(dá)，而在突觸形成后又會(huì)下降。本實(shí)驗(yàn)通過RT－PCR法分別檢測(cè)術(shù)后2周、4周、6周和8周GAP－43在各組動(dòng)物模型中的表達(dá)，觀察PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管移植后大鼠脊髓GAP－43mRNA表達(dá)及功能恢復(fù)情況。本實(shí)驗(yàn)各組大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，術(shù)后2周時(shí)，完全脊髓損傷組（A組）、單一應(yīng)用GDNF（B組）、單一應(yīng)用PLA－PTMC植入組（C組）、復(fù)合導(dǎo)管組（D組）的GAP43mRNA表達(dá)均增加，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05），A－D各組間相比無顯著性差異（P＞0.05），這表明雖然各組行為學(xué)評(píng)分這時(shí)得分較低，但軸突已開始有再生。術(shù)后4周時(shí)，D組與B組的GAP－43 mRNA表達(dá)相比無顯著性差異（P＞0.05），但D組和B組分別與A組和C組相比增高明顯，有顯著性差異（P＞0.05），表明軸突再生較多。術(shù)后6周時(shí)，D組與A組、B組、C組的GAP－43mRNA表達(dá)相比增高明顯，D組6周時(shí)與其4周時(shí)相比明顯增高（P＜0.05），表明此時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)再生最活躍；8周時(shí)，AD組的GAP43mRNA表達(dá)較6周時(shí)下降，表明神經(jīng)再生趨于穩(wěn)定，D組的GAP－43mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組及A－C組相仍增高（P＜0.05）。從上述GAP－43mRNA表達(dá)變化來看，雖在術(shù)后第4周時(shí)D組與B組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在術(shù)后第4周、6周和第8周時(shí)D組與其它各脊髓損傷組（A組、B組、C組）的GAP－43mRNA表達(dá)均增高明顯，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而其他各脊髓損傷組各周GAP43 mRNA表達(dá)變化幅度不明顯或僅有一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上有明顯改變。結(jié)果顯示GDNF同PLA－PTMC導(dǎo)管二者協(xié)同作用能更為顯著的促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)再生。

綜上所述，神經(jīng)再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，并具有挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域。在過去幾十年的有關(guān)脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的進(jìn)展成果令人印象深刻。本實(shí)驗(yàn)為治療SCI提供了一個(gè)新的方法，如果在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)試神經(jīng)通過的成功率并改進(jìn)PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管的性能，可進(jìn)一步開展PLA－PTMC／GDNF復(fù)合導(dǎo)管治療SCI的亞臨床研究，為SCI的再生修復(fù)治療帶來了新的希望。

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The influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the protein expression of GAP－43 mRNA in spinal cord injury of rats

SHAO Guo－xi，JIAO Jing－xue，LIU Qin－yi，et al.（The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the mRNA expression of GAP－43in spinal cord injury of rats.MethodsTo explore the mRNA expression of GAP－43at molecular biological level with RTPCR to make certain the difference between PLA－PTMC／GDNF and others.ResultsA，B，C，D groups showed high protein expression at 2weeks，and there is no significant difference among these groups.B，D groups had significant higher expression at 4weeks than that of two weeks.D group showed high protein expression at 6weeks than other groups and all groups showed higher expression.At 8weeks，all groups showed lower expression of GAP－43mRNA，but D group showed more expression than others.ConclusionPLA－Poly－PTMC／GDNF is more helpful for axon regeneration spinal cord recovery.

Spinal cord injury；PLA－poly trimethylene carbonate；glial cell line－derived neurotrophic factor；catheter implantation

R744

A

2014－07－30）

1007－4287（2015）02－0198－04

吉林省科技廳國(guó)際合作課題資助（20120721）

＊通訊作者