金 磊

（徐州醫(yī)學院醫(yī)學生物化學與分子生物學教學實驗中心，江蘇徐州221002）

核酸染色劑SYBR－Gold染色特性分析

金 磊

（徐州醫(yī)學院醫(yī)學生物化學與分子生物學教學實驗中心，江蘇徐州221002）

目的檢測SYBR－Gold前染色與后染色的優(yōu)缺點。方法采用前染色、后染色的方法使用SYBR－Gold對雙鏈DNA進行染色檢測，EB染色作為參照，瓊脂糖凝膠電泳為檢測手段，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。結(jié)果SYBRGold其前染色與后染色對于雙鏈DNA檢測能力均強于EB染色，但是SYBR－Gold預混凝膠前染色其分辨效果及DNA遷移速度受到DNA濃度的影響；SYBR－Gold預混樣品的前染色方式對于目的基因的判讀誤差較大。結(jié)論SYBR－Gold不適合預混樣品前染色，DNA樣品濃度過大（大于250ng）不適合預混凝膠前染色，SYBR－Gold后染色是理想的染色方式。

SYBR－Gold；溴化乙錠；核酸染色劑；瓊脂糖凝膠電泳

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0194）

核酸染色在基因工程領(lǐng)域應用非常廣泛，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳可以分離、鑒定DNA片段大小，對于DNA濃度也可以根據(jù)熒光激發(fā)強度進行半定量［1］。目前，對于凝膠染色的核酸染色劑，溴化乙錠（Ethidium bromide、EB）仍然占據(jù)主導地位，EB可以結(jié)合雙鏈DNA、單鏈DNA以及RNA，EB結(jié)合雙鏈DNA后熒光強度激發(fā)比游離凝膠中的EB發(fā)出的熒光強度大20－25倍［2］，具備優(yōu)越的DNA檢測能力，在瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠中可分別檢測痕量的雙鏈DNA。但是EB具有致突變性，對于環(huán)境安全有一定影響［3］。

隨著對核酸染色劑研究的深入以及化學合成技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些經(jīng)過改進的花青類核酸染色劑，相對于EB具有染色靈敏度高、環(huán)保、對核酸的結(jié)合具有選擇性等特點。比如SYBR GreenⅠ結(jié)合雙鏈DNA能力遠強于單鏈DNA及RNA，因此可以作為實時定量PCR的核酸染色劑，SYBR－Gold可以結(jié)合雙鏈DNA、單鏈DNA及RNA，在結(jié)合雙鏈DNA后具有2個熒光激發(fā)峰，一個位于300nm處，另一個位于495nm處，且對于核酸的檢測能力均高于EB及其他SYBR系列的染色劑［4］。而且安全、環(huán)保，已有文獻報到SYBR Gold在Ames實驗中沒有發(fā)現(xiàn)至突變性［5］。但是SYBR－Gold試劑價格要遠高于EB，為了降低使用成本，使用SYBRGold做前染色的優(yōu)勢報道越來越多［6］，尤其是使用SYBR－Gold染色樣品的前染色方式會極大的節(jié)約試劑的用量［7，8］，而另有文獻報道這種染色方式會使得DNA遷移速度發(fā)生滯后［4］。因此本文使用EB作為參照，使用后染色及前染色兩種染色方式評估SYBR－Gold在檢測雙鏈DNA的靈敏度以及染色特點，給選擇使用SYBR－Gold以及適合這種染色劑的染色方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株原核表達載體pXMCB－B2及菌種JM101為為本實驗室保存

1.2 主要試劑PCR體系、分析級瓊脂糖凝膠、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司、凝膠純化試劑盒購自生工（上海）生物工程有限公司、1kbDNA ladder、100bpDNA ladder、Gel loading Dye 6x購自NEB公司，SYBR－Gold in DMSO購自invitrogen公司；EB、DMSO購自Sigma公司，1xTBE緩沖液（final concentrations of 45mmol／L Tris－Boric Acid，2mmol／L EDTA PH：8.3）為實驗室配置。

1.3 前染色及1%凝膠配置稱取0.6g瓊脂糖溶于60ml 1xTBE緩沖液中，使用65℃水浴加熱待瓊脂糖全部融化，量筒分別量取30ml凝膠共2份，分別加入SYBR－Gold（10000x）3μl、EB（0.5μg／ml）3μl混勻后分別灌至6x6cm膠槽中，然后放置于室溫約1小時待其凝固。后染色凝膠配置同前染色，但是凝膠中不加染色劑。

1.4 后染色電泳結(jié)束后將不含染色劑凝膠放入1xTBE緩沖液的容器中，使凝膠完全侵入緩沖液，緩沖液中分別含SYBR－Gold：10000x、EB：0.5μg／ml，搖床低速染色40min。

1.5 電泳將無染色劑凝膠放入同一電泳槽，含染色劑凝膠使用單獨電泳槽在同一條件下分別電泳。電壓1.5V／cm2，時間60min。

1.6 目的基因的擴增與純化使用實驗室保存質(zhì)粒為模板，使用特異性上游、下游引物擴增長度為711 bp的目的基因，PCR反應程序為94℃預變性2min、94℃變性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min；變性、退火、延伸共計25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。測序正確后使用凝膠純化系統(tǒng)進行純化。

1.7 PCR產(chǎn)物的濃度測定取2μl的PCR產(chǎn)物，使用Thermo公司的NanoDrop2000系統(tǒng)進行DNA濃度測定，然后將DNA稀釋至25ng／μl凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 DNA ladder濃度與SYBR－Gold濃度稀釋1kb DNA ladder按照每6μl 8ng、16ng、35ng、63ng、125 ng、250ng、500ng的濃度稀釋配置備用；其中500ng從0.5kb到10kb每條帶對應質(zhì)量為42ng、42ng、36ng、48ng、125ng、33ng、42ng、50ng、42ng、42ng，其余濃度按照稀釋倍數(shù)類推。SYBR－Gold按照1∶167、1∶333、1∶667、1∶1 000稀釋于60%DMSO中，染色樣品后SYBR－Gold被稀釋6倍，其終濃度為：1∶1 000 1∶2 000 1∶4 000 1∶6 000。

2 結(jié)果

2.1 EB與SYBR－Gold預混凝膠前染色特性分析

如圖A、B分別為EB與SYBR－Gold前染色，1－7上樣量分別為：8ng、16ng、32ng、63ng、125ng、250ng、500ng電泳在同一條件下進行，電泳結(jié)束后立即拍照，我們發(fā)現(xiàn)：1、EB與SYBR－Gold對于雙鏈DNA最小檢測量能力與DNA片段大小相關(guān)，對于0.5kb的DNA片段EB最小檢測量約為5ng（第4列），而SYBR－Gold最小檢測量約為0.6ng（第7列），隨著DNA片段的增大，兩種染色劑的檢測能力均有所增強，3－10kb的DNA片段EB的最小檢測量約為0.6ng（第1列），而SYBR－Gold染色至第一列仍然較清晰，因此SYBR－Gold的前染色的最小檢測量應小于0.6ng。2、EB染色較SYBR－Gold染色分辨效果好，SYBR－Gold前染色的分辨效果與DNA濃度相關(guān)，當DNA總濃度為250ng以上時（第6列），3－10kb的DNA條帶不能分辨。3、SYBR－Gold染色當濃度為250ng以上時，3－10kb的DNA條帶其遷移速度明顯增加。因此SYBRGold預混凝膠前染色不適合檢測濃度超過250ng的DNA品。

圖1 A：EB前染色，B：SYBR－Gold前染色，1－7樣品質(zhì)量為：8 ng、16 ng、35 ng、63 ng、125 ng、250 ng、500 ng，從0.5 kb至10 kb相應DNA條帶為0.5 kb、1 kb、1.5 kb、，2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、8 kb、10kb。

2.2 EB與SYBR－Gold后染色特性分析

凝膠后染色是電泳完畢后再進行單獨染色，因此DNA條帶在介質(zhì)中移動不受染色劑干擾，對于目的基因判斷更準確，DNA也不易產(chǎn)生彎曲、變形、拖尾等現(xiàn)象。后染色使用的樣品DNA、上樣量、電泳條件與前染色完全一致，電泳結(jié)束后將凝膠分別放入含有EB（0.5μg／ml）與SYBR－Gold（10000x）的1xTBE緩沖液中進行后染色，如圖2，A為EB后染色，B為SYBR－Gold后染色。結(jié)果顯示：后染色檢測雙鏈DNA的效果較前染色更有優(yōu)勢，EB后染色對于0.5kb的雙鏈DNA片段最小檢測量約為2.7ng（第3列），而3kb之后的雙鏈DNA片段最小檢測量至少為0.6ng（第1列），而SYBR－Gold后染色每條DNA條帶都清晰可見，由此可見SYBRGold后染色對于雙鏈DNA檢測的靈敏度優(yōu)于EB染色及SYBR－Gold前染色。

圖2 A：EB后染色，B：SYBR－Gold后染色，1－7樣品質(zhì)量為：8 ng、16 ng、35 ng、63 ng、125 ng、250 ng、500 ng，從0.5 kb至10 kb相應DNA條帶為0.5 kb、1 kb、1.5 kb、，2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、8 kb、10 kb。

圖3 SYBR－Gold預混樣品前染色，1－4 SYBR－Gold稀釋倍數(shù)為1∶1000 1∶2000 1∶4000 1∶6000。

2.3 SYBR－Gold預混樣品前染色特性分析

有報道稱染樣品法的前染色可以極大的節(jié)省染色劑的用量［7，8］，SYBR－Gold是否適合此種染色方法，我們進行檢測，如圖3，1－4分別是將SYBR－Gold按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000的終濃度染色250ng的DNA樣品，并在避光的環(huán)境中靜止15分鐘，然后進行電泳。我們發(fā)現(xiàn)隨著SYBRGold濃度的稀釋，不僅DNA條帶的熒光強度發(fā)生衰減，而且DNA的遷移速度也逐漸增快。這種現(xiàn)象說明SYBR－Gold稀釋濃度會影響DNA的遷移速度。另外有文獻報道，SYBR－Gold預混樣品前染色其遷移速度也會受到DNA濃度影響［9］。

2.4 SYBR－Gold預混樣品對目的基因判斷的影響

通過上述實驗發(fā)現(xiàn)SYBR－Gold預混樣品的染色方式中，其稀釋濃度會影響DNA的遷移速度，這種現(xiàn)象對于使用分子量標準DNA來判斷目的基因片段大小是否會發(fā)生顯著影響，我們進一步檢測，。如圖4－A，1－8為按照比例稀釋在DMSO中的SYBR－Gold同時染色目的基因（711bp）與分子量標準DNA（100bp DNA ladder，NEB），SYBR－Gold的終濃度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000，在避光環(huán)境中放置15分鐘后電泳檢測，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度稀釋的SYBR－Gold對目的基因的判斷不盡相同，圖中分子量標準DNA在0.5kb與1kb之間依次為0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb，相同目的基因樣品（711bp），其大小在各濃度稀釋的SYBRGold染色的情況下依次為：約1kb（1∶1 000）、約0.95kb（1∶2 000）、約0.85kb（1∶4 000）、約0.95 kb（1∶6 000）。圖4－B為SYBR－Gold后染色作為參照?？梢娫诿糠NSYBR－Gold濃度稀釋情況下目的基因的判讀與其實際大小均不符，最接近實際大小的0.85bp仍然誤差約140bp（約20%），無法達到實驗要求，因此我們認為SYBR－Gold不適合預混樣品的前染色方式。

圖4 A：SYBR－Gold預混樣品前染色，SYBR－Gold稀釋倍數(shù)為1∶1000（1、2）1∶2000（3、4）1∶4000（5、6）1∶6000（7、8），目的基因大小711 bp。B：SYBR－Gold后染色。

3 討論

基于熒光信號為基礎(chǔ)的核酸染色劑仍然是檢測核酸的重要手段，通常結(jié)合凝膠電泳的方法來鑒定分析核酸片段大小，也可根據(jù)熒光強度對核酸濃度進行半定量，傳統(tǒng)染色劑對于單鏈DNA的檢測能力要弱很多，在一些實際工作中，比如以RNA為模板構(gòu)建cDNA基因文庫，EB對于核酸的檢測能力往往不能滿足需求，一些新型核酸染色劑的問世大大提高了核酸的檢測能力，PicoGreen是一種很靈敏的雙鏈DNA定量試劑，在熒光儀上可檢測雙鏈DNA的最低濃度為25pg／ml，檢測精度比傳統(tǒng)方法提高100倍，另外PicoGreen定量檢測不會受到單鏈DNA及RNA的干擾［10］。一些新技術(shù)的建立也提高了核酸的檢測能力，比如使用堿性品紅在聚丙烯酰胺凝膠中可以檢測10－20pg的DNA［11］，競爭逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合SYBR－Gold染色可以對mRNA進行定量分析［12］。另外在凝膠成像系統(tǒng)中適當延長曝光時間也可以提高核酸的檢測能力，因此，即便是相同的核酸染色劑，合理的使用不同的檢測方法可以提高核酸的檢測水平。在本文中，兩種核酸染色劑使用后染色的方式對于雙鏈DNA的檢測能力均強于前染色。SYBR－Gold在這方面尤為明顯，雖然SYBR－Gold在前染色方面易受到諸多因素的干擾，但是其優(yōu)異的后染色能力、在Ames實驗中無至突變性、環(huán)保、用量很少等優(yōu)勢使SYBR－Gold越來越多的被廣大科研人員接受。

［1］Lee PY，Costumbrado J，Hsu CY，et al.Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments［J］.J Vis Exp，2012，62：3791.

［2］Vardevanyan P.O，Antonyan A.P，The binding of ethidium bromide with DNA：interaction with single－and double－stranded structures［J］.Experimental and molecular medicine，2003，6：527.

［3］Victoria L，Singer Timothy E.Lawlor，Stephen Yue.Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella／mammalian microsome reverse mutation assay（Ames test）［J］.Mutation Research，1999，439：37.

［4］Rabiya S.Tuma，Matthew P.Beaudet，Xiaokui Jin，et al.Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain：A Dye Optimized for Use with 300－nm Ultraviolet Transilluminators［J］.Analytical Biochemistry，1999，439：278.

［5］Kirill I.Kirsanov，Ekaterina A.Lesovaya，Marianna G.Yakubovskaya，SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in the Ames test［J］.Mutation Research，2010，699：1.

［6］Suenaga E，Nakamura H.Prestaining method as a useful tool for the agarose gel electrophoretic detection of polymerase chain reaction products with a fluorescent dye SYBR gold nucleic acid gel stain［J］.Anal Sci，2005，6：619

［7］Huang Q，Baum L，Simple and Practical Staining of DNA with GelRed in Agarose Gel Electrophoresis［J］.Clin Lab，2010，56：149.

［8］Robert K.and Ingeborg T.Prestaining of PCR products with SYBR Green for agarose gel electrophoresis：advantages and limitations［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（6）：1069.

［9］Huang Q，F(xiàn)u WL，Comparative analysis of the DNA staining effi－ciencies of different fluorescent dyes in preparative agarose gel electrophoresis［J］.Clin.Lab，2010，56：149.

［10］Li X，Wu Y，Zhang L，et al.Comparison of three common DNA concentration measurement methods［J］.Anal Biochem，2014，451：18.

［11］Chen M1，Cong WT，Zhou X，et al.A method for sensitive staining of DNA in polyacrylamide gels using basic fuchsin［J］.Bio－analysis，2013，12：1545.

［12］Oba R，Kudo Y，Sato N，et al.A new method of competitive reverse transcription polymerase chain reaction with SYBR Gold staining for quantitative analysis of mRNA［J］.Electrophoresis，2006，14：2865

The Characterization of SYBR Gold nucleic acid dye

JIN Lei.（Experimental center for Medical Biochemistry and

Molecular Biology Teaching.Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）

ObjectiveIt is analyse two method for staining DNA fragments in agarosewith SYBR－Gold.MethodsIt used poststaining and prestaining to dye double strand DNA in agarose gel electrophoresis.The same way is used to stain DNA with EB as a control.And we analysed the results by the gel imaging system.ResultsWe found SYBR－Gold was much more sensitive than EB to detect double strand DNA.But the effect of resolution and the mobility of DNA fragments were affiliated to the concentration of the samples in precasting SYBR－Gold in gels.And it was low accurate in measuring the size of DNA fragments through the agarose gel with adding SYBR－Gold in loading buffer.ConclusionWe do not recommend that you stain the sample with SYBR－Gold before agarose gel electrophoresis.It is also not suitable to precast SYBR－Gold in gels when the concentration of samples is too high.However，the poststain with SYBR－Gold is an ideal method.

SYBR－Gold、EB、nucleic acid dye、agarose gel electrophoresis

R392.3

A

2014－08－16）

1007－4287（2015）02－0194－05

國家自然科學基金項目（81100852）