朱婷 聶青和 王媛媛 高祿化 龍振晝 李汨

目前，對于丙型肝炎尚無有效的預防性疫苗［1］。由于細胞受體是HCV入侵宿主細胞的門戶，是抗病毒藥物最佳靶點之一。因此，HCV受體一直是研究熱點，它對于今后有效控制HCV感染及其藥物的研發(fā)具有重要意義［2］。HCV受體主要包括CD81、B族I型清道夫受體（scavenger receptor class B typeI，SRBI）、緊密連接蛋白家族、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子－3－結合非整合素分子（DCSIGN）等［3］。研究表明，C型凝集素CLEC4M可能是介導HCV入胞的重要分子［4］。為此，本研究構建了GV166－CLEC4M慢病毒載體，使其在 Huh7.5細胞過表達，獲得穩(wěn)定過表達CLEC4M的細胞系，應用HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，即體外培養(yǎng)的 HCV（cell cultured HCV，HCVcc）感染過表達 CLEC4M 的Huh7.5細胞，了解CLEC4M的表達對HCVcc易感性的影響。

資料和方法

一、材料

人肝癌細胞系Huh－7.5細胞、包含HCV全長序列的載體pFL－J6/JFH 由本室保存，GV166－CLEC4M慢病毒載體由本室構建并保存；DMEM、胰蛋白酶、FBS、NEAA購自美國Gibco公司；XBaI購自立陶宛MBI Fermentas公司、蛋白酶 K、RNA Marker RL 5000為TaKaRa公司產品；PageRulerTM 蛋白marker購自中國Fermentas公司；GenEluteDNA純化試劑盒為美國Sigma公司產品；PureLink質粒小量提取試劑盒為美國Invitrogen公司產品；T7 AmpliScribe體外轉錄試劑盒為美國Thermo公司產品；RNeasy RNA Mini Kit為德國Qiagen公司產品，抗GFP多克隆抗體購自美國eBioscience公司，鼠抗人CLEC4M抗體、兔抗人HCV NS5a抗體、山羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司，HCV熒光定量試劑盒購自深圳凱杰生物工程有限公司。

二、方法

（一）HCVcc的培養(yǎng)及感染測定 參照文獻［5］。將 HCV pFL－J6/JFH－1（2a基因型）質粒10μL（濃度200 ng/μL），加入限制性內切酶 XbaI 2μL，37℃水浴，酶切3.5 h，使質粒線性化。按照GenElute DNA純化試劑盒操作說明書，進行線性化DNA純化。采用紫外分光光度計檢測DNA純化后的濃度。按照Thermo Scientific TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit操作說明對DNA模板進行體外轉錄，然后按照Qiagen RNeasy試劑盒操作說明，純化RNA產物，測定濃度，分裝。提前將Huh7.5細胞鋪至6孔培養(yǎng)板中，顯微鏡下觀察融合度達80%左右時，將Huh7.5細胞培養(yǎng)上清棄去，用DMEM洗滌。提前對Opti－MEM和轉染試劑DMRIE－C進行混勻，待細胞準備好時加入6孔培養(yǎng)板中，并設置對照孔（只加入Opti－MEM）。37℃，體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱內，培養(yǎng)4 h后，將轉染液倒掉，加入2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃培養(yǎng)16 h～24 h后，收集培養(yǎng)上清，3500 r/min，離心10 min，0.2μm 濾器過濾，采用實時定量PCR和間接免疫熒光法檢測感染性，分裝，待用。

（二）穩(wěn)定過表達GV166－CLEC4M的 Huh7.5細胞系的建立 GV166－CLEC4M慢病毒載體的構建相關方法參見文獻［6］。用制備好的GV166－CLEC4M和GV166－空載體共同轉染 Huh7.5細胞。轉染前12 h～24 h按1.5×105個/孔將 Huh7.5細胞接種到6孔培養(yǎng)板；當細胞融合達30%～50%后，去除培養(yǎng)液，加入 MOI為50的稀釋后的GV166－CLEC4M 和GV166－空載體病毒液1 mL，同時加入Polybrene，終濃度為8 mg/L，37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉染后8 h去除含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉染后24 h，加入G418（600μg/mL）進行篩選。篩選3 d后換液，將G418濃度調整為600 ng/mL 和300μg/mL；培養(yǎng)7 d，換完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，分 別 命 名 為 Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166。

（三）Western印跡和RT－PCR檢測Huh7.5細胞上GV166－CLEC4M的表達 Western印跡方法以GAPDH為內參照物，分別提取原始Huh7.5細胞、Huh7.5－CLEC4M細胞蛋白，用BCA測定試劑盒取上清測蛋白濃度，每個樣本蛋白終濃度調整為2μg/μL，－80℃保存?zhèn)溆谩?種蛋白各取2.0g樣品蛋白經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉2 h。加入1∶100抗CLEC4M一抗，1∶5 000的GAPDH，4℃孵育過夜，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。加入二抗室溫孵育2 h，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。封口，壓片，顯 影 后 讀 片。RT－PCR 檢 測：參 照CLEC4M（Genbank注冊號為NM－014257）核苷酸序列，上游引物：5′－AATTCCGTGGTGTTGTCG－3′；下游 引 物：5′－AAGGTCCGCTGGATTGAG－3′。 提 取Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166，原始 Huh7.5細胞的總RNA，RevertAiD反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，加入CLEC4M上游及下游引物，以cDNA為模板進行擴增。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，40個循環(huán)，72℃10 min。RT－PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

（四）CLEC4M表達與HCVcc結合實驗及競爭抑制實驗 結合實驗中，細胞共分為3組，陽性對照組：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；陰性對照組：Huh7.5－GV166＋ HCVcc病毒液；空白對照組：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。競爭抑制實驗：細胞共分為4組，陽性對照組：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；單克隆抗體干擾組：Huh7.5－CLEC4M＋鼠抗人CLEC4M單克隆抗體＋HCVcc病毒液；甘露聚糖干擾組：Huh7.5－CLEC4M＋甘露聚糖＋HCVcc病毒液?？瞻捉M對照組：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。干擾組在加入HCVcc病毒液前，分別加入鼠抗人CLEC4M單克隆抗體和甘露聚糖進行干預，其余兩組加入同體積的PBS。

（五）免疫熒光檢測CLEC4M對HCVcc的易感性的影響 感染48 h后取出12孔板中提前放置的蓋玻片，放入4%多聚甲醛固定，4℃，30 min，PBS漂洗3遍，每次3～5min，然后過 ddH2O。加入0.2%TrionX－100室溫透化10 min，PBS漂洗3遍，每次5 min，過ddH2O。37℃，5%BSA溶液封閉1 h，PBS漂洗3遍，每次5 min，過ddH2O。加入HCV NS5a抗體，4℃，過夜。加入Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG，37℃ 濕育1 h，PBS漂洗漂洗5遍，每次5 min，過ddH2O。50%甘油封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

（六）實時PCR 加入病毒液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，洗凈未結合的病毒，換取新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集24 h上清液，進行熒光定量PCR，檢測感染細胞的HCV RNA含量。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、過表達GV166－CLEC4M 的 Huh7.5細胞的檢測

（一）Western印跡檢測 Huh7.5－CLEC4M 的表達 經檢測穩(wěn)定過表達GV166－CLEC4M的Huh7.5細胞，可在相對分子質量為46×103處有特征性條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。而原始Huh7.5細胞未見特征性條帶（圖1）。說明經轉染后Huh7.5細胞穩(wěn)定過表達GV166－CLEC4M。

（二 ）RT－PCR 檢 測 Huh7.5 細 胞 上 GV166－CLEC4M的表達

提取各類細胞總RNA，經RT－PCR檢測，過表達CLEC4M的Huh7.5細胞在1 200 bp可見明顯條帶，而空載體和原始Huh7.5細胞在此位置未見條帶。說明轉染后的Huh7.5可以過表達CLEC4M（圖2）。

二、免疫熒光檢測CLEC4M對HCVcc的易感性的影響

間接免疫熒光染色后，陽性對照組的熒光強度明顯強于單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組?？瞻讓φ战M未見黃綠色熒光（圖3）。

圖1 Western印跡檢測Huh7.5－CLEC4M表達

圖2 RT－PCR檢測 Huh7.5細胞 GV166－CLEC4M

圖3 CLEC4M對HCVcc的易感性影響的免疫熒光結果（×50）

三、RT－PCR

各組細胞經最后一次清洗液RT－PCR檢測結果為陰性，說明已將未結合的HCV洗脫，排除了未結合的HCVcc造成的影響。熒光定量PCR檢測HCV RNA水平，結果顯示，陽性對照組比陰性對照組HCVcc易感性明顯增強。陽性對照組和陰性對照組與空白對照組相比，對HCVcc易感性差異有統(tǒng)計學意義（圖4）。競爭抑制實驗中，陽性對照組HCVcc易感性明顯增高，單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組與陽性對照組相比，其對HCVcc易感性較低。而各組水平均較空白對照組高（圖5）。

圖4 CLEC4M表達與HCVcc結合實驗熒光定量PCR結果

圖5 CLEC4M表達與HCVcc競爭抑制實驗熒光定量PCR結果

討 論

C型凝集素CLEC4M（又稱DC－SIGNR），是一種外源C型植物凝素的Ⅱ型跨膜蛋白，與DC－SIGN具有同源的基因及蛋白結構，由7個外顯子、6個內含子組成［7］。與DC－SIGN不同的是，CLEC4M 專一地、大量地選擇性表達于成熟和未成熟的肝竇內皮細胞、淋巴竇內皮細胞及胎盤毛細血管［8－9］。胞外區(qū)C端包含一個糖基結合位點，可通過鈣離子依賴方式與病毒糖基結合，其N末端相連高甘露糖寡糖，通過高甘露糖寡糖對sE2有高度親和力。其天然配體為ICAM－3，主要表達于T淋巴細胞上，加工提呈的抗原可以被大量的T淋巴細胞受體所識別，為早期與CLEC4M的相互作用奠定了基礎［10］。

HCV入胞是一個多因素參與的復雜過程，需要多種分子介導或參與，包括 CD81、SR－BI、CLDN1、Occludin、DC－SIGN和LDLR等。CD81和SR－BI目前已經被證明是HCV感染細胞的不可或缺的細胞受體［11］。近期研究表明，C型凝集素CLEC4M有可能介導HCV入胞過程。我們在前期研究中，從外周血中分離出CD14＋細胞，應用IL－4，GM－CSF刺激誘導出成熟DC細胞，運用HCV RNA陽性患者血清感染DC細胞，并設置單克隆抗體和甘露聚糖干擾組的競爭抑制實驗。研究顯示，經單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組的細胞感染效率明顯低于陽性對照組，說明CLEC4M可能在HCV感染過程中扮演著重要角色［12］。

近年來，慢病毒載體因其具有宿主范圍廣、轉基因效率高且安全性好等突出優(yōu)勢而在基礎和臨床研究中得到廣泛應用［13］。與其他病毒載體相比，慢病毒不僅具有能夠轉染分裂期和非分裂期細胞，并穩(wěn)定表達治療基因、無明顯免疫反應等特性，而且可以廣泛轉染組織，病毒液濃縮成高滴度。

因此，基于Huh7.5細胞可以同時表達CD81和SR－BI，而不表達 CLEC4M 分子，構 建 了 過 表 達CLEC4M慢病毒載體并轉染Huh7.5細胞。轉染的Huh7.5細胞經過G418篩選后獲得穩(wěn)定過表達CLEC4M的Huh7.5細胞系。HCVcc感染穩(wěn)定過表達CLEC4M的Huh7.5細胞和空載體細胞，研究結果顯示過表達CLEC4M的Huh7.5細胞的感染效率高于空載體組。應用單克隆抗體和甘露聚糖干擾，進行競爭抑制實驗。研究發(fā)現(xiàn)，陽性對照組的HCV RNA明顯高于單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組，而單克隆抗體干擾組與甘露聚糖干擾組差異無統(tǒng)計學意義。

本研究顯示，CLEC4M在HCV入胞過程中扮演著重要角色。DC是功能強大的專職抗原遞呈細胞［14］。成熟DC表面可以高表達CLEC4M，因此，推測CLEC4M分子是DC能夠逃逸HCV免疫機制的重要原因，更深層的意義是為臨床及基礎工作在慢性丙型肝炎治療提供新的思路，為預防性疫苗的研究提供理論依據(jù)［15］。

1 Kohli A，Shaffer A，Sherman A，et al.Treatment of hepatitis C：a systematic review.JAMA，2014，312：631－640.

2 高祿化，聶青和.CLEC4L介導丙型肝炎病毒感染人胎盤滋養(yǎng)層細胞的作用機制.臨床肝膽病雜志，2012，28：941－944.

3 Zhang F，Ren S，Zuo Y.DC－SIGN，DC－SIGNR and LSECtin：C－type lectins for infection.Int Rev Immunol，2014，33：54－66.

4 Zhao LJ，Wang W，Ren H，et al.Interaction of L－SIGN with hepatitis C virus envelope protein E2 up－regulates Raf－MEK－ERK pathway.Cell Biochem Biophys，2013，66：589－597.

5 Lindenbach BD1，Evans MJ，Syder AJ，et al.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science，2005，309：623－626.

6 王媛媛，聶青和，朱婷.CLEC4M慢病毒載體的構建及其在K－562細胞中的表達.臨床肝膽病雜志，2014，30：518－521.

7 王媛媛，聶青和，高祿化.CLEC4M與丙型肝炎病毒感染的研究進展.肝臟，2012，17：426－429.

8 Khoo US，Chan KY，Chan VS，et al.DC－SIGN and L－SIGN：the SIGNs for infection.J Mol Med（Berl），2008，86：861－874.

9 高祿化，聶青和，王媛媛.CLEC4L在人胎盤組織及滋養(yǎng)層細胞的分布與定位研究.肝臟，2012，17：636－639.

10 Chen PC，Chuang PK，Chen CH，et al.Role of N－linked glycans in the interactions of recombinant HCV envelope glycoproteins with cellular receptors.ACS Chem Biol，2014，9：1437－1443.

11 Samreen B，Khaliq S，Ashfaq UA，et al.Hepatitis C virus entry：role of host and viral factors.Infect Genet Evol，2012，12：1699－709.

12 王媛媛，聶青和，高祿化.CLEC4M介導HCV感染人PBDCs實驗研究.肝臟，2013，18：231－234.

13 Rothe M，Modlich U，Schambach A.Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy.Curr Gene Ther，2013，13：453－468.

14 Li J，F(xiàn)eng ZH，Nie QH，et al.Expression of dendritic cell－specific intercellular adhesion molecule 3 grabbing nonintegrin on dendritic cells generated from human peripheral blood monocytes.World J Gastroenterol，2006，12：453－456.

15 Park CG.Vaccine strategies utilizing C－type lectin receptors on dendritic cells in vivo.Clin Exp Vaccine Res，2014，3：149－154.