梁 錚,柏彩英,羅婭莎,張 文,藍(lán) 鍇,李苗苗,周 強(qiáng)△(.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣州 500；.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣州 5000；.廣東醫(yī)學(xué)院，廣州 5808)

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·論 著·

MALDI-TOF-MS技術(shù)快速鑒定臨床酵母樣真菌的應(yīng)用評價*

梁 錚1,柏彩英2,羅婭莎1,張 文1,藍(lán) 鍇1,李苗苗3,周 強(qiáng)1△(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣州 510120；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣州 510010；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣州 523808)

目的 評價基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)在快速鑒定臨床分離的酵母樣真菌中的應(yīng)用價值。方法 收集臨床分離的酵母樣真菌135株，分別用VITEK MS、API20C和CHROMargar顯色培養(yǎng)同時進(jìn)行鑒定與比較，χ2檢驗分析VITEK MS和API及顯色培養(yǎng)基鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率，以真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因測序作為鑒定結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)，同時比較各種方法在臨床使用中的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果 VITEK MS、API20C和顯色培養(yǎng)基鑒定的準(zhǔn)確率分別為98.5%(133/135)、78.5%(106/135)、59.3%(80/135)，經(jīng)χ2檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=51.996，P<0.05)。結(jié)論 MALDI-TOF-MS可將酵母樣真菌快速、準(zhǔn)確地鑒定到種。

酵母樣真菌； MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析； ITS基因測序

近年來，深部真菌感染發(fā)生率和病死率在逐年增加[1]，其中以白色假絲酵母為主，其他酵母菌樣真菌也頻繁被檢出。傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要有CHROMagar顯色培養(yǎng)基和生化鑒定系統(tǒng)如API20C、全自動微生物鑒定儀Vitek、Microscan及Biolog鑒定系統(tǒng)等，這些檢測需較長周期和較高成本，難以鑒定不常見或生化反應(yīng)相近的真菌；分子學(xué)鑒定方法(如熒光雜交和PCR)快速、準(zhǔn)確，但對實驗室要求較高，難進(jìn)行推廣。基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF-MS)是應(yīng)用于病原微生物快速檢測的一項新技術(shù)，不同的病原菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測可以形成特異性的指紋圖譜，將待測病原菌的質(zhì)譜圖與已有質(zhì)譜圖庫進(jìn)行比較，即可確定病原菌種屬，擁有快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點(diǎn)，本文將探討法國生物梅里埃VITEK MS質(zhì)譜儀在臨床酵母樣真菌快速鑒定中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 收集分離自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2014年3～12月臨床痰、尿液、分泌物、皮膚刮取物、骨髓等標(biāo)本的酵母樣真菌135株，通過真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析確定菌種分布如下：近平滑假絲酵母菌17株，白色假絲酵母菌32株，光滑假絲酵母菌22株，熱帶假絲酵母菌21株，克柔假絲酵母菌16株，季也蒙假絲酵母菌9株，皺褶絲酵母菌4株，阿薩絲酵母菌7株，紅酵母菌2株，新型隱球菌3株，季也蒙畢赤酵母2株，標(biāo)本用真菌濾紙保藏法(載體保藏法)-80 ℃冷凍保存。

1.2 試劑與儀器 酵母基因組DNA提取液、PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，API20C 系統(tǒng)酵母菌鑒定試劑盒，CHROMargar顯色培養(yǎng)基，VITEK MS(Biomerieux)，PCR儀(ABI9700)，水平電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)等。

1.3 方法

1.3.1 顯色培養(yǎng)基鑒定 按臨床常規(guī)的表型鑒定流程，沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得真菌菌株均進(jìn)行菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)觀察，酵母菌行顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)菌落顏色判定。

1.3.2 API20C鑒定 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 VITEK MS鑒定 在VITEK MS標(biāo)本準(zhǔn)備工作站，按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成標(biāo)本準(zhǔn)備工作；待所有標(biāo)本準(zhǔn)備完成或整塊靶板點(diǎn)位涂滿菌，放進(jìn)檢測口檢測；檢測結(jié)束進(jìn)入MYLA軟件對質(zhì)譜圖行進(jìn)行鑒定。

1.3.4 ITS測序 提取135株菌株的DNA，擴(kuò)增其ITS基因，回收PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，具體方法參看文獻(xiàn)[2-3]。測序結(jié)果通過BLAST檢索與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，找出與之相似的序列，序列同源性不低于97%確定為同屬，同源性不低于99%視為同種[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3種方法準(zhǔn)確率的比較 VITEK MS、API20C和顯色培養(yǎng)3種方法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率分別為98.5%(133/135)、78.5%(106/135)和59.3%(80/135)，經(jīng)χ2分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=51.996，P<0.05)，VITEK MS與API20C兩組組間比較同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.566，P<0.05)。

2.2 VITEK MS、API20C鑒定結(jié)果不同菌株的分析 MS與API鑒定結(jié)果共有25株菌不一致，API對光滑與近平滑假絲酵母菌，季也蒙假絲酵母菌與新型隱球菌的鑒定有較高的錯判率。見表1。

表1 VITEK MS、API20C鑒定結(jié)果不一致真菌

2.3 3種方法臨床應(yīng)用特點(diǎn)的比較 VITEK MS、API20C、顯色培養(yǎng)3種鑒定方法在臨床鑒定中所需時間，經(jīng)濟(jì)成本，結(jié)果判讀等特點(diǎn)的比較見表2。

表2 VITEK MS、API20C、顯色培養(yǎng)3種鑒定方法 臨床應(yīng)用特點(diǎn)的比較

注：*所需時間指菌落長出后至鑒定出結(jié)果所需時間。

3 討 論

本試驗收集的135株酵母樣真菌中使用VITEK MS方法成功鑒定了133株，正確率98.5%與國外文獻(xiàn)報道(92.5%～99.0%)接近[5]，明顯高于API20C(78.5%)和顯色培養(yǎng)鑒定法(59.3%)；2株菌未成功鑒定的真菌ITS測序結(jié)果為季也蒙畢赤酵母，MS鑒定為季也蒙假絲酵母菌，前者實則是后者的有性期階段。試驗數(shù)據(jù)表明VITEK MS能快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地鑒定臨床分離的酵母樣真菌。

傳統(tǒng)的生物表型鑒定方法雖能準(zhǔn)確鑒定大部分的酵母菌，但不常見的菌株則可能鑒定失敗[6]。顯色培養(yǎng)基一般可鑒定4種常見酵母菌，但不同人在顏色辨別上存在一定差異或顯色不典型容易造成鑒定錯誤，本試驗數(shù)據(jù)表明顯色培養(yǎng)正確率明顯低于MS和API，其中有1株光滑念珠菌顯為藍(lán)灰色(典型的顯色為紫色)。API20C試驗對光滑與近平滑假絲酵母菌，季也蒙假絲酵母菌與新型隱球菌的鑒定有較高的錯判率，對阿薩絲酵母菌、克柔假絲酵母菌也出現(xiàn)錯誤鑒定。而克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥，因此API鑒定結(jié)果為克柔假絲酵母菌時應(yīng)結(jié)合其他方法確認(rèn)，以免誤導(dǎo)治療。在本次試驗中API20C鑒定正確率78.5%，明顯低于國內(nèi)、國外文獻(xiàn)報道[2,7-8]，原因可能是板條濁度判讀結(jié)果依賴于操作人員熟練程度和所研究菌種構(gòu)成比等因素導(dǎo)致了研究結(jié)果的差異,這也反映了該方法在結(jié)果判讀方面不夠客觀，易造成誤判。

從臨床應(yīng)用的情況分析，VITEK MS操作簡單，實驗準(zhǔn)備時間和出報告的時間較短，單次檢測的成本較低，儀器自動判讀結(jié)果人為因素影響較少。綜合各方面因素，VITEK MS能滿足臨床微生物實驗室快速、準(zhǔn)確鑒定病原體的需求。在一些研究中，VITEK MS不能正確地鑒定菌株是因為數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的圖譜有限或菌庫尚未包含這些菌株，質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)不充分導(dǎo)致得分較低。隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，質(zhì)譜圖庫數(shù)據(jù)將會得到進(jìn)一步的補(bǔ)充，可使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

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Application evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for rapid identification of clinically isolated yeast-like fungi*

LIANGZheng1,BOCai-ying2,LUOYa-sha1,ZHANGWen1,LANKai1,LIMiao-miao3,ZhouQiang1△

(1.SecondClinicalMedicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China;2.DepartmentofClinicialLaboratory,GuangzhouMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Guangzhou,Guangdong510010,China;3.GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,Guangdong523808,China)

Objective To evaluate the application value of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) for rapid identification of clinically isolated yeast-like fungi.Methods 135 strains of clinically isolated yeast-like fungi were collected and identified by VITEK MS,API20C system and CHROMagar Candida at the same time,then the detection results were compared,the accuracy of detected results were analyzed by the χ2test,the identification of the ITS gene sequence of these isolates were taken as the gold standard.At the same time the advantages and disadvantages in the clinical application of these methods were compared.Results The identification accuracy rates of VITEK MS,API20C and CHROMagar Candida were 98.5%(133/135)，78.5%(106/135) and 59.3%(80/135) respectively,the differences were statistically significant (χ2=51.996，P<0.05).Conclusion MALDI-TOF-MS could rapidly and accurately identify yeast-like fungi.

yeast-like fungi; MALDI-TOF-MS; ITS gene sequencing

廣東省科技計劃項目(2011B031800028)；廣東省科技計劃項目(粵科社字[2011]106號)。 作者簡介：梁錚，男，碩士，主管技師，主要從事微生物耐藥機(jī)制研究?！?/p>

，E-mail：zq_zhouqiang@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.005

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1672-9455(2015)18-2659-02

2015-04-15

2015-05-15)