費(fèi)春明 葉勁軍 周?chē)?guó)仁 何飛 張小東 曾勇

Skp2 表達(dá)對(duì)食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響

費(fèi)春明 葉勁軍 周?chē)?guó)仁 何飛 張小東 曾勇

目的 研究Skp2表達(dá)對(duì)食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響。 方法 對(duì)74例食管癌手術(shù)切除患者的病理標(biāo)本進(jìn)行Skp2免疫組化染色,并收集術(shù)后完整臨床資料及隨訪(fǎng)資料,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)可能影響食管癌預(yù)后的因素進(jìn)行分析,用Log-rank檢驗(yàn)分析Skp2對(duì)總生存期(OS)、無(wú)腫瘤生存期(DFS)、局部無(wú)復(fù)發(fā)生存期(LRFS)及遠(yuǎn)處無(wú)復(fù)發(fā)生存期(DMFS)的影響。 結(jié)果 食管癌組織中Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率為47.3%。Skp2表達(dá)陰性患者的3年及5年生存率顯著高于Skp2表達(dá)陽(yáng)性患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在食管癌組織中Skp2的表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM分期有關(guān)(P均<0.01)。Skp2高表達(dá)食管癌患者術(shù)后OS、DSF、DMSF及LRFS顯著低于Skp2低表達(dá)患者(P<0.05)。Cox多因素回歸分析表明, TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Skp2表達(dá)是食管癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。 結(jié)論 Skp2過(guò)表達(dá)是食管癌術(shù)后預(yù)后不良的重要因素。

食管癌; Skp2; 食管癌切除術(shù); 免疫組化染色

我國(guó)是食管癌(esophageal cancer)高發(fā)地區(qū),其發(fā)病人數(shù)占世界發(fā)病人口的1/2以上。臨床對(duì)食管癌治療的主要手段是手術(shù),即使對(duì)患者實(shí)施有效的手術(shù)治療,單純手術(shù)治療后5年生存率<25%;而術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)34%～79%[1-2]。Skp2是Skp2/SCF(Skp1-Cullin1-F-box)復(fù)合體的識(shí)別亞單位。與多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如p27、p21等泛素化降解有關(guān),其表達(dá)異常增高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。目前發(fā)現(xiàn)Skp2在多種腫瘤中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象,并與腫瘤細(xì)胞異常增殖及不良預(yù)后有關(guān)[3]。本研究探討Skp2對(duì)食管癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市六合區(qū)人民醫(yī)院病理科2004年1月至2009年12月均未行化療、放療、免疫治療的食管癌患者手術(shù)標(biāo)本74例,所有標(biāo)本均為病理科存檔蠟塊。所有患者均有完整的病歷資料、隨訪(fǎng)資料,隨訪(fǎng)時(shí)間為60月。其中男46例,女28例。年齡47～78 歲,平均61.3±5.7歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理均為鱗癌;(2)均為根治性切除。腫瘤部位根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)2009分段標(biāo)準(zhǔn):胸上段14例,胸中段35例,胸下段25例。臨床病理分期按食管癌國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)第7版(UICC, 2009版):臨床分期0～Ⅰ 期22例,Ⅱ期26例,Ⅲ期26例。組織學(xué)分化程度:高分化鱗癌19例,中分化鱗癌26例,低分化鱗癌29例。

1.2 試劑 即用型兔抗人Skp2 p45(H-435):sc-7164多克隆抗體,購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。通用型二抗、DAB試劑購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋。切片厚0.4 μm,常規(guī)HE染色,光鏡下行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察,以確定病理診斷及分組。免疫組化染色采用二步法En vision系統(tǒng),檢測(cè)食管癌組織中的Skp2表達(dá)情況,按試劑盒說(shuō)明操作。以TBS 代替一抗、二抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 Skp2蛋白免疫組化染色結(jié)果以細(xì)胞核出現(xiàn)淺黃色至深棕色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果按陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷,參照Naoki法[4]。陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤10%,無(wú)棕黃色或與背景著色一致為(-);陽(yáng)性細(xì)胞百分比10%～20%為(±),陽(yáng)性細(xì)胞百分比21%～80%為(+),陽(yáng)性細(xì)胞百分比>80%為(++)。以(-)和(±)為陰性,(+)和(++)定義為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 Skp2蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況 Skp2蛋白染色陽(yáng)性主要定位于食管癌腫瘤細(xì)胞核,高分化食管癌組織的Skp2傾向于表達(dá)陰性,低分化食管癌組織Skp2傾向于表達(dá)陽(yáng)性(圖1)。Skp2蛋白免疫組化染色結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞百分比為26%～78.3%。Skp2蛋白在74例食管癌患者中陽(yáng)性率為47.30%(35/74)。

注:A為高分化食管鱗癌Skp2表達(dá),B為低分化食管鱗癌Skp2表達(dá)。圖1 Skp2在食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

2.2 Skp2蛋白表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Skp2的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期、組織學(xué)分化程度有關(guān)。組織學(xué)分化程度越低,其陽(yáng)性率越高(P<0.001);腫瘤浸潤(rùn)深度越深,其陽(yáng)性率越高(P<0.05);臨床TNM分期越晚,其陽(yáng)性率越高(P<0.001);有淋巴結(jié)侵入和轉(zhuǎn)移的食管癌患者Skp2陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)侵入和轉(zhuǎn)移者(P<0.001)。但Skp2蛋白的表達(dá)與食管癌患者的性別、年齡、腫瘤部位無(wú)關(guān),見(jiàn)表1。

表1 Skp2蛋白表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系(n,%)

2.3 隨訪(fǎng)結(jié)果和生存狀況 74例食管癌患者的1年總生存率為91.8%,3年生存率為56.0%,5年生存率為37.8%。中位生存期為41.37月。至隨訪(fǎng)截止日期,死亡45例,生存24例。Skp2蛋白表達(dá)陰性患者的3年生存率為76.5%,5年生存率為63.3%;而Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的3年生存率為23.6%,5年生存率為8.85%。

2.4 Skp2與生存期關(guān)系 采用Log-rank分析方法進(jìn)行生存統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示:Skp2陰性表達(dá)的病人總生存期(OS)(χ2=38.061,P<0.001)、無(wú)腫瘤生存期(DFS)(χ2=13.867,P<0.001),局部無(wú)復(fù)發(fā)生存期(LRFS)(χ2=9.487,P=0.002)及遠(yuǎn)處無(wú)復(fù)發(fā)生存期(DMFS)(χ2=26.900,P<0.001)顯著高于Skp2陽(yáng)性患者。

2.5 影響食管癌預(yù)后的因素分析 影響術(shù)后生存期的單因素分析表明:腫瘤的浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤組織中Skp2陽(yáng)性表達(dá)是影響術(shù)后生存期的因素(表2)。進(jìn)一步進(jìn)行Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn):僅有組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、TNM分期、Skp2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤患者的生存期有關(guān)。見(jiàn)表3。

表2 影響患者預(yù)后的單因素分析

表3 影響患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

3 討論

手術(shù)是食管癌治療的主要手段, 但目前手術(shù)治療后5年生存率仍較低。食管癌的預(yù)后除了與TNM分期等臨床指標(biāo)有關(guān)外,分子病理學(xué)研究顯示,多種基因和蛋白調(diào)控紊亂和表達(dá)異常如p27、HIF等均與食管癌的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并且是影響預(yù)后的重要因素[5]。目前研究表明多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白與食管癌的增殖明顯相關(guān),如p21、p27、cyclinD1[6-7]。因此,研究食管癌這些基因及蛋白與手術(shù)后的預(yù)后關(guān)系,有助于發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)的高危人群,對(duì)改善食管癌患者的預(yù)后,提高生存率具有重要的臨床意義。

Skp2首先因其為S期Cdk2/Cyclin A相關(guān)蛋白被人們所發(fā)現(xiàn)[8]。Skp2是F-box家族成員,Skp2/SCF (Skp1-Cullin1-F-box) 復(fù)合體的識(shí)別亞單位,后者負(fù)責(zé)蛋白的泛素化連接并隨之被26S蛋白酶體降解。多種與細(xì)胞周期負(fù)性相關(guān)蛋白通過(guò)Skp2介導(dǎo)泛素化降解,包括:p21、p57、p27、p130等[8-9]。 因而,Skp2過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。在肺癌、頭頸部癌、乳腺癌、黏液纖維肉瘤[10]等多種腫瘤中Skp2均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。研究證明除了促進(jìn)細(xì)胞增殖,Skp2過(guò)表達(dá)還與多種腫瘤的侵襲性表型如細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-12]。近來(lái)研究表明Skp2還與腫瘤的放化療敏感性有關(guān)[13]。Skp2與ErbB家族誘導(dǎo)的Akt泛素化降解、有氧酵解、腫瘤發(fā)生有關(guān)。研究表明在多種腫瘤中,Skp2表達(dá)異常增高,并與腫瘤惡性程度及不良預(yù)后有關(guān)[14],Skp2是多種腫瘤不良預(yù)后的獨(dú)立因素[15]。

本研究顯示,Skp2表達(dá)與食管癌腫瘤大小、病理分級(jí)、TNM分期、腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素明顯相關(guān),提示其與食管癌生物侵襲活性有關(guān)。74例食管癌患者的1年生存率為85%, 3年生存率為55%, 5年生存率為38%。患者的隨訪(fǎng)時(shí)間最短為5月,平均隨訪(fǎng)時(shí)間為41.37月。至隨訪(fǎng)截止日期, 死亡病例為45例,生存病例為24例。Skp2表達(dá)與食管癌術(shù)后生存期明顯相關(guān),Skp2陰性患者的3年、5年生存期顯著高于Skp2陽(yáng)性患者。我們通過(guò)對(duì)Skp2表達(dá)與患者OS、DSF、LRSF、DMFS進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Skp2表達(dá)與食管癌患者OS、DSF、LRSF、DMFS相關(guān),其表達(dá)陽(yáng)性患者的OS、DSF、DMSF及LRSF顯著低于陰性患者,提示Skp2在食管癌發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,這一作用可能與Skp2具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)。

單因素分析表明:病理組織學(xué)分化程度、TNM分期、腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及食管癌組織中Skp2表達(dá)是影響患者術(shù)后生存的因素。多因素分析顯示,組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Skp2表達(dá)陽(yáng)性是影響腫瘤患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。我們的研究結(jié)果與Liang等[16]研究結(jié)果一致。因而我們認(rèn)為Skp2是重要的食管癌手術(shù)治療預(yù)后不良因素,可以作為術(shù)后評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)。

[1] Yang L,Parkin DM,Li L,et al.Time trends in cancer mortality in China: 1987-1999[J]. Int J Cancer,2003,106(5):771-783.

[2] Lee SJ,Lee KS,Yim YJ,et al.Recurrence of squamous cell carcinoma of the oesophagus after curative surgery: rates and patterns on imaging studies correlated with tumour location and pathological stage[J]. Clin Radiol,2005,60(5):547-554.

[3] Hershko DD.Oncogenic properties and prognostic implications of the ubiquitin ligase Skp2 in cancer[J]. Cancer,2008,112(7):1415-1424.

[4] 羅四維,彭先兵,張群,等.Skp2結(jié)構(gòu)與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2010,24(2):110-112.

[5] Ping W,Sun W,Zu Y,et al. Clinicopathological and prognostic significance of hypoxia-inducible factor-1α in esophageal squamous cell carcinoma: a meta-analysis[J]. Tumour Biol,2014,35(5):4401-4409.

[6] Shiozaki A,Nakashima S,Ichikawa D,et al.Prognostic significance of p21 expression in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Anticancer Res,2013,33(10):4329-4335.

[7] Tong Q,Zhang W,Jin S,et al.The relationship between p27(kip1) expression and the change of radiosensitivity of esophageal carcinoma cells[J]. Scand J Gastroenterol,2011,46(2):173-176.

[8] Bhattacharya S,Garriga J,Calbó J,et al.SKP2 associates with p130 and accelerates p130 ubiquitylation and degradation in human cells[J].Oncogene,2003,22(16):2443-2451.

[10]Huang HY,Kang HY,Li CF,et al.Skp2 overexpression is highly representative of intrinsic biological aggressiveness and independently associated with poor prognosis in primary localized myxofibrosarcomas[J].Clin Cancer Res，2006,12(2):487-498.

[11]Chan CH,Lee SW,Li CF,et al.Deciphering the transcriptional complex critical for RhoA gene expression and cancer metastasis[J].Nat Cell Biol,2010,12(5):457-467.

[12]Li CF,Wang JM,Kang HY,et al.Characterization of gene amplification-driven skp2 overexpression in myxofibrosarcoma: potential implications in tumor progression and therapeutics[J].Clin Cancer Res,2012,18(6):1598-1610.

[13]Wang XC,Tian LL,Tian J,et al.Overexpression of SKP2 promotes the radiation resistance of esophageal squamous cell carcinoma[J].Radiat Res,2012,177(1):52-58.

[14]Tian YF,Chen TJ,Lin CY,et al.SKP2 overexpression is associated with a poor prognosis of rectal cancer treated with chemoradiotherapy and represents a therapeutic target with high potential[J].Tumour Biol，2013,34(2):1107-1117.

[15]Oliveira AM,Okuno SH,Nascimento AG,et al.Skp2 protein expression in soft tissue sarcomas[J].J Clin Oncol,2003,21(4):722-727.

[16]Liang Y，Hou X，Cui Q, et al.Skp2 expression unfavorably impacts survival in resectable esophageal squamous cell carcinoma[J].J Transl Med, 2012，10:73.

Effects of Skp2 overexpression on postoperative recurrence and prognosis in patients with esophageal cancer

FEIChun-ming,HEFei,ZHANGXiao-dong,ZENGYong.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedNanjingLuheDistrictPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing211500,China;YEJin-jun,ZHOUGuo-ren.DepartmentofRadiotherapy,AffiliatedJiangsuCancerHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210009,China

Objective To study the effects of Skp2 overexpression on the postoperative recurrence and prognosis of esophageal cancer. Methods The pathological specimens of 74 patients with surgical resection of esophageal cancer were used for Skp2 immunohistochemical staining. In addition, complete postoperative clinical information and follow-up data were collected for statistical analysis. The parameters that might influence the prognosis results of esophageal cancer were analyzed using the Cox proportional hazards model. The effects of Skp2 on overall survival (OS), disease-free survival (DFS), local recurrence-free survival (LRFS), and distant metastasis-free survival (DMFS) were analyzed using the Log-rank test. Results The positive Skp2 expression rate in esophageal cancer tissues was 47.3%. The 3-year and 5-year survival rate of the patients with negative Skp2 expression were significantly higher than those in patients with positive Skp2 expression. Skp2 expression was associated with lymph node metastasis, infiltration depth, and TNM staging of esophageal cancer (P<0.01).The results of the multivariate Cox regression analysis showed that TNM staging, tumor infiltration depth, lymph node metastasis, and Skp2 expression were independent predictors for the survival of esophageal cancer patients. The postoperative OS, DSF, DMSF, and LRFS rates of the patients with high levels of Skp2 expression were significantly worse than those with low levels of Skp2 expression. Conclusions Skp2 overexpression is an important factor of a poor postoperative prognosis of esophageal cancer.

esophageal cancer; Skp2; esophagectomy for esophageal cancer; immunohistochemical staining

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(YKK11183)

211500江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市六合區(qū)人民醫(yī)院消化科(費(fèi)春明，何飛，張小東，曾勇)；210009江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院放療科(葉勁軍，周?chē)?guó)仁)

曾勇，Email：Zengyong@whhyyy.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.020

2015-09-08)