張婷 李明新

(1.徐州醫(yī)學(xué)院;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221000)

康柏西普對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞屏障功能及VEGF表達的影響*

張婷1李明新2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221000)

目的探討康柏西普對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞屏障功能及VEGF表達的影響。方法將人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞分為正常組(5.5mol/L葡萄糖)、高糖組(25mol/L葡萄糖)、高糖+不同濃度(25μg/L、2.5 μg/L、0.25μg/L)的康柏西普組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測各組細胞上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度;跨膜電阻(TER)及辣根過氧化物酶(HRP)通透性的檢測，以評價細胞屏障的穩(wěn)定性;蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測緊密連接相關(guān)蛋白occludin的表達。結(jié)果ELISA結(jié)果示:高糖組分泌的VEGF比正常組高，增加差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，各康柏西普組能抑制高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞VEGF的分泌; Western blot示:25μg/L、2.5μg/L康柏西普組occludin蛋白表達量較高糖組高(P＜0.05)，但0.25μg/L康柏西普與高糖組無明顯差異(P＞0.05);TER值、HRP通透性檢測示:康柏西普能抑制高糖組TER值的降低，并抑制HRP通透性的增加。結(jié)論康柏西普對高糖環(huán)境下血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障具有一定的保護作用，其機制可能與VEGF有關(guān)。

康柏西普;高糖;視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞;屏障功能

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病相關(guān)眼病的最為嚴重的并發(fā)癥，DR引起的黃斑水腫(DME)，也是世界上最常見的致盲眼疾［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制中具有重要的作用，VEGF的高表達在DR的各期均可出現(xiàn)［2］，而過多的VEGF會破壞血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)的形成及功能［3-4］。內(nèi)層血-視網(wǎng)膜屏障主要由視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞及細胞之間的連接共同構(gòu)成，阻礙血液的滲透及內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)在視網(wǎng)膜中的自由擴散，以穩(wěn)定視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境。近年來，抗VEGF藥物在減輕血管滲漏和改善黃斑水腫的治療中取得了一定的進展，使患者的視力得到了一定的改善［5-7］。本研究旨在探討康柏西普對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(human retinalmicrovascular endothelial cells，hRMECs)內(nèi)屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(上海拜力公司，編號:6520);高糖DMEM(美國Hyclone公司)，低糖DMEM(美國Hyclone公司);胎牛血清(上海玉博);0.25%胰酶(碧云天);青鏈霉素(碧云天);人血管內(nèi)皮生長因子酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)試劑盒(上海玉博);兔源性occludin抗體(美國Abcam公司);堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋);6孔板、24孔板(美國corning公司);Millicell插入式培養(yǎng)皿(美國millipro公司);辣根過氧化物酶(美國sigma公司);TBM顯色劑(碧云天);蛋白質(zhì)印跡法相關(guān)試劑(碧云天);康柏西普(成都康弘)。

1.2 方法與步驟

1.2.1 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的低糖DMEM(5.5 mmol/L的葡萄糖)在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組細胞經(jīng)胰酶消化后，以適當(dāng)比例接種于6孔、24孔細胞培養(yǎng)板中，待其貼壁后，用含5%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞生長同步化，將細胞分組，分別給予如下干預(yù):正常組(N組，5.5 mmol/L的葡萄糖)、高糖組(H組，25 mmol/L的葡萄糖)、高糖+康柏西普組(H125μg/ m l、H22.5μg/ml、H30.25μg/ml)。

1.2.3 VEGF的檢測以4×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，按實驗分組進行干預(yù)，再培養(yǎng)24小時后收集上清液，，按照人血管內(nèi)皮生長因子ELISA試劑盒說明進行操作。酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出相應(yīng)VEGF的濃度。

1.2.4 跨細胞膜電阻(TER)的檢測應(yīng)用細胞電阻儀(EVOM)測定各組細胞24 h、46 h、48 h、60 h、72 h的TER值，未接種細胞，僅有培養(yǎng)液的實驗孔為空白對照。將STX2筷式電極的短臂與長臂分別置于millicell插入式培養(yǎng)池的內(nèi)、外室，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值，每個培養(yǎng)池測量3次，取平均值［8］。RPE細胞TER值=(實驗孔電阻值-空白孔電阻值)/0.33，單位為Ω/cm2。

1.2.5 HRP通透性的檢測以5×104個/ml的密度將hRMECs細胞懸液500μl接種于Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿(直徑6.5 mm，孔徑0.4μm)上;常規(guī)條件下培養(yǎng)待其鋪滿單層，加藥干預(yù)24小時后，上室加入50 mg/L的HRP，2 min后收集下室液體以10μl/孔置于96孔板中，加入200μl TMB顯色液，15 min后用酶標(biāo)儀測定A值，用A值反映血管內(nèi)皮細胞的相對通透性［9］。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 Western blot檢測occludin蛋白的表達提取各組細胞的總蛋白，加入80μl含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，將各組蛋白濃度調(diào)一致后，加入上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。取蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠中電泳，待目的蛋白接近凝膠底部時停止電泳，4℃、120 V恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，稀釋的一抗4℃過夜，漂洗后，稀釋的二抗室溫孵育1小時。漂洗后用ECL定影、顯影，并掃描分析。用Image J醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析圖像，測定其灰度值。以β-actin為參照，測定occludin蛋白的相對表達量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時用Welch校正后使用Dunnett’s T3檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P≤0.05，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的濃度檢測結(jié)果各組VEGF濃度見圖1。正常組、高糖組及高糖加藥組(25μg/m l、2.5 μg/ml、0.25μg/ml)的VEGF濃度分別為(73.10± 3.32)、(162.06±4.80)、(3.95±2.40)、(11.02± 2.25)、(29.73±2.98)pg/ml，H組與N組相比VEGF濃度明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 1.18，P＜0.05);康柏西普能夠顯著降低細胞VEGF的分泌量，H組與各加藥組之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且VEGF的表達隨康柏西普濃度增加而降低;加藥各組VEGF的表達均低于正常組(P＜0.05)。

圖1 各組細胞分泌VEGF的濃度(pg/m l)

2.2 TER檢測結(jié)果各組hRMECs單層細胞TER值得檢測結(jié)果見表1。24 h、36 h、48 h、60 h、72 h各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各時間段N組TER值均明顯高于H組(P＜0.05);各時間段加藥各組檢測的TER值均大于H組(P＜0.05);各時間段組間進行兩兩比較，24 h、36 h、48 h時H2、H3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，72h時N組與H1組的TER值差異無統(tǒng)計學(xué)意義;H組TER值從36小時開始隨時間的延長逐漸減小。

表1 各組不同時間細胞屏障TER值

表1 各組不同時間細胞屏障TER值

注:不同時間段，N組與H組比較，P＜0.05，H組與加藥組比較，P＜0.05，H組TER值從36小時開始隨時間延長而減少。

9.6組別9.7±3.5 H組80.6±2.2 83.2±1.7 74.0±4.3 65.6±5.5 55.5±4.6 H1組101.3±6.7 120.7±2.6 109.8±6.5 128.7±2.9 139.1±6.8 H2組92.2±3.6 102.1±3.9 100.6±3.2 115.1±4.7 125.1±4.1 H3組90.1±6.1 96.9±5.1 96.4±4.1 106.1±3.4 112.1± 24h 36h 48h 60h 72h N組126.1±3.9 134.7±2.4 135.8±8.1 135.4±4.33 13

2.3 各組HRP通透性檢測結(jié)果各組辣根過氧化物酶通透性檢測的A值見表2。各個時段高糖作用下的HRP通透性檢測結(jié)果均明顯高于正常組(P＜0.05);24h、48h、72h組間進行兩兩比較(P＜0.05);各個時段加藥組HRP通透性A值均小于高糖組(P＜0.05);高糖組A值隨時間的延長不斷增加;各組間交互圖見圖2。

表2 各組不同時間HRP通透性

表2 各組不同時間HRP通透性

時間N組H組H1組H2組H3組24h 0.719±0.101 2.742±0.081 1.283±0.065 1.691±0.139 2.025±0.092 48h 0.578±0.040 2.922±0.036 1.306±0.023 1.491±0.090 1.889±0.063 72h 0.490±0.034 3.271±0.092 1.100±0.100 1.455±0.056 1.728±0.074

圖2 各組細胞HRP通透性(A值)

2.4 Western blot檢測結(jié)果各組泳道均有occludin蛋白表達的特異性條帶(圖3)。高糖環(huán)境下occludin的表達較正常組低(P＜0.05);2.5μg/ml、25μg/ml加藥組occludin的表達高于H組(P＜ 0.05);0.25μg/ml組與H組相比occludin的表達無明顯差異(P＞0.05)。

圖3 各組細胞occludin蛋白表達量

3 討論

越來越多的實驗證明了VEGF是DR、DME的發(fā)生以及發(fā)展的重要因子［11-13］，其中的一個原因就是引起細胞的滲透性增加，而這種滲透性又是由緊密連接蛋白決定的［14］。occludin蛋白是緊密連接中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與其他緊密連接蛋白結(jié)合產(chǎn)生嚴密的細胞旁封閉，共同維持細胞間緊密連接屏障的正常生理功能。目前認為occludin功能廣泛，包括屏障功能，維持細胞兩側(cè)的物質(zhì)差異和保持細胞的極性，還可調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖和分化［15-16］。糖尿病性視網(wǎng)膜病變中顯著表達升高的VEGF可使內(nèi)皮細胞間緊密連接的Occludin和ZO-l蛋白磷酸化［17］，使這些蛋白的數(shù)量以及分布發(fā)生異常，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞間連接出現(xiàn)窗口甚至中斷［18-19］，這是VEGF導(dǎo)致血管滲漏的重要機制。因此，拮抗VEGF過度表達可以作為治療DM繼發(fā)黃斑水腫的重要手段。

目前，應(yīng)用于眼科的抗VEGF的藥物有阿柏西普(aflibercept)，雷珠單抗(ranibizumab)，貝伐單抗(bevacizumab)和康柏西普(conbercept)，康柏西普由我國康弘公司生產(chǎn)，2013年12月批準(zhǔn)用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。康柏西普作為一種抗血管內(nèi)皮生長因子的融合蛋白，可阻斷VEGF-A所有亞型、VEGF-B及胎盤生長因子，可完全穿透視網(wǎng)膜，親和力強、作用時間長［20-21］。本實驗將康柏西普作用于高糖下生長的hRMECs，通過觀察細胞通透性指標(biāo)，評價康柏西普對單層hRMEC屏障作用的影響。

本研究中，通過不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基作為對比，以葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的培養(yǎng)基為正常組，葡萄糖濃度為25 mmol/L的培養(yǎng)基為高糖組，以高濃度的葡萄糖模擬患者組織及細胞所處的高糖環(huán)境。結(jié)果顯示，高糖組視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF明顯增加，而對高糖環(huán)境下的hRMECs加入不同濃度的康柏西普后，顯著的抑制了VEGF的表達，同時，我們還觀察到加藥組的VEGF表達低于正常組。Boyd等［22］發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)水平的VEGF起著維持原有血管密度及維持血管對運輸營養(yǎng)物質(zhì)所必需的通透性的作用，那么，康柏西普顯著抑制VEGF的同時是否影響VEGF正常生理功能的發(fā)揮，還有待進一步的研究。血管內(nèi)皮細胞具有離子電荷屏障的功能特性，TER［23］是由離子經(jīng)細胞旁間隔的流動形成的，離子的流動受多種因素的影響，如細胞本身狀態(tài)、培養(yǎng)基的成分、孔徑等因素。因此在體外條件下，通過檢測融合成狀單層的內(nèi)皮細胞的TER值，能夠反映出內(nèi)皮細胞離子電荷屏障的某些生理學(xué)特征，反映出內(nèi)皮細胞間的完整性。各個時段高糖組TER值與其他組比較均為最低，不同藥物濃度的康柏西普組的TER值在各時段均高于高糖組。各個時段高糖組HRP檢測的A值均高于正常組，各時段各加藥組A值均小于高糖組。TER的測量和用HRP進行的通透性檢測可間接地反映屏障功能的完整性，是可以用來描述屏障功能建立情況的客觀指標(biāo)。由以上結(jié)果仍可得出，通透性的提高往往伴隨著TER的降低，TER值越高，單層細胞的屏障功能越穩(wěn)定。

綜上所述，康柏西普能抑制高糖環(huán)境下hRMECs分泌VEGF，使occludin蛋白的表達增加，hRMECs單層細胞通透性降低。但康柏西普對單層細胞屏障功能的機制尚未得到闡明，以及康柏西普對抑制VEGF與受體結(jié)合所可能引起的不良反應(yīng)還有待進一步的研究。因此，為使康柏西普更合理、有效、安全的應(yīng)用于臨床，進一步更深入探討康柏西普的作用機制具有重大意義。

［1］Rosales M A，Silva K C，Duarte D A，et al.Endocytosis of tight junctions caveolin nitrosylation dependent is improved by cocoa via opioid receptoron RPE cells in diabetic conditions［J］.Investigative Ophthalmology＆Visual Science，2014，55(9):6090-6100.

［2］Deissler H L，Lang G K，Lang G E.Capacity of aflibercept to counteract VEGF-stimulated abnormalbehavior of retinalmicrovascular endothelial cells［J］.Experimental Eye Research，2014，122:20-31.

［3］Barber AJ，Antonetti DA，Gardner TW，et al.Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes［J］.InvestOphthalmol Vis Sci，2000，4 1:3561-3568.

［4］Murata T，Ishibashi T，Khalil A，et al.Vascular endothelial growth factor p lays a role in hyperpermeability of diabetic retinalvessels［J］.Ophthalmic Res，1995，27:48-52.

［5］Stefani F R，Badaro E，F(xiàn)alabella P，et al.Anti-VEGF for the management of diabeticmacular edema［J］.Journal of Immunology Research，2014，2014:632307.

［6］Klettner A，Recber M，Rodider J.Comparison of the efficacy of aflibercept，ranibizumab，and bevacizumab in an RPE/choroid organ culture［J］.Graefe＇s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology，2014，252(10):1593-1598.

［7］劉姝林，陳有信.抗VEGF藥物治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞并發(fā)黃斑水腫的Meta分析［J］.中華實驗眼科雜志，2014，32(1):56-61.

［8］Liu Z，Meyer C H，Stanzel B V，et al.Effect of novel vital dyes on outer blood-retina barrier function in cultured human retinal pigment epithelium［J］.Ophthalmologica Journal International d＇ophtalmologie International journal of ophthalmology Zeitschrift fur Augenheilkunde，2013，230(2):33-40.

［9］古妮娜，張丹，羅麗，等.嗜鉻粒蛋白A衍生多肽CGA47-66抑制膿毒癥血清所致血管內(nèi)皮細胞高通透性的研究，［J］.中華危重病急救醫(yī)學(xué)2013，12(8):715-719.

［10］W ill Whitmire，Mohammed MH Al-Gayyar，Mohammed Abdelsaid，et al.Alteration ofgrowth factors and neuronal death in diabetic retinopathy:whatwe have learned so far［J］.Molecular Vision，2011，17:300-308.

［11］StewartMW.Critical appraisalof ranibizumab in the treatment of diabetic macular edema［J］.Clinical ophthalmology，2013，7: 1257-1267.

［12］Wang J，Xu X，Elliott M H，et al.Muller cell-derived VEGF is essential for diabetes-induced retinal inflammation and vascular leakage［J］.Diabetes，2010，59(9):2297-2305.

［13］Kowluru R A，Zhong Q，Kanwar M.Metabolicmemory and diabetic retinopathy:role of inflammatory mediators in retinal pericytes［J］.Experimental eye research，2010，90(5):617-623.

［14］Haurigot V，Villacampa P，Ribera A，et al.Increased intraocular insulin-like growth factor-I triggers blood-retinal barrier breakdown［J］.JBiol Chem 2009，284:22961-22969.

［15］Koval M，Ward C，F(xiàn)indley MK，et al.Extracellular matrix influences alveolar epithelial claudin expression and barrier function［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2010，42:172-180.

［16］Tsukita S，Yamazaki Y，Katsuno T，et al.Tight junctionbased epithelial microenvironment and cell proliferation［J］.Oncogene，2008，27:6930-6938.

［17］Antonetti DA，Barber AJ，Khin S，et al.Vascular permeability in experimental diabetes is associated with reduced endothelial occludin content:vascular endothelial growth factor decreases occludin in retinal endothelial cells［J］.Penn State Retina Research Group Diabetes，1998，47:1953-1959.

［18］Esser S，Wolburg K，Wolburg H，et al.Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro［J］.JCell Biol，1998，140:947-959.

［19］Dobroguwska DH，Lossinsky AS，Tarnawski M，et al.Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor［J］.J Neurseytol，1998，27:163-173.

［20］Wang Q，Li T，Wu Z，et al.Novel VEGF decoy receptor fusion protein conbercept targetingmultiple VEGF isoforms provide remarkable anti-angiogenesis effect in vivo［J］.PLoSOne，2013，8 (8):8-12.

［21］Wu Zh，Zhou P，Li X，et a1.Structural characterization of a recombinant fusion protein by instrumental analysis and molecular modeling［J］.PLoSOne，2013，8(3):3-4.

［22］Boyd SR，Zachary I，Chakravarthy U，et al.Correlation of increased vascular endothelial growthfactor with neovascularization and permeability in ischemic central vein occlusion［J］.Arch 0phthalm，2002，120(12):1644-1650.

［23］Cai RL，Wang M，Qi Y，et al.Selection and utilization on the evaluation criterions of Caco-2 cell model［J］.Chin Pham J，2008，43:1871-1875.

Effects of conbercept on human retinalm icrovascular endothelial cells barrier function and expression of VEGF in high glucose environment

ZHANG Ting1LIMing-xin2
(1.Xuzhou Medical College，2.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221000，China)

Objective:To investigate the effects of conbercept on human retinal microvascular endothelial cells (hRMECs)barrier function and expression of VEGF in high glucose environment.Methods:The hRMECs were divided into 5 groups:controlgroup(Group N)，high glucose group(Group H)，and treatment groups(high glucose with different concentration of conbercept).The examination of vascular endothelial growth factor(VEGF)was done by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The protein level of occludin in each group was detected by western blot.Transendothelial electrical resistance(TER)and the permeability of horseradish peroxidase(HRP)were detected to evaluate the stability of barrier function of hRMEC.Results:The level of VEGF in group H is significantly different from that in group N(P＜0.05).However，this effectwas significantly inhibited by conbercept treatment(P＜0.05).The concentration of25μg/L，2.5μg/L conbercept increased protein level of occludin compared with group H，which was not found in the concentration of 0.25μg/L conbercept.Conbercept suppressed not only the reducation of TER value but also the increase in permeability of HRP.Conclusion:Conbercept can protect the barrier function of hRMECs against high glucose，whosemechanism might be associated with VEGF.

conbercept;high glucose;retinalmicrovascular endothelial cells;barrier function

R774

A

1004-7115(2015)09-0985-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.09.001

2015-04-01)

張婷(1988—)，女，碩士研究生，研究方向:眼底病。

李明新。