許蕾 韓建國 李家鋒

(1.徐州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221004;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科，江蘇徐州221002)

人BMP-2體外定向誘導(dǎo)犬BMSCs向成骨方向分化的實(shí)驗(yàn)研究*

許蕾1韓建國1李家鋒2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221004;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科，江蘇徐州221002)

目的通過將犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymal stem cells，BMSCs)建立體外培養(yǎng)體系，運(yùn)用人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，為后期建立骨組織工程提供種子細(xì)胞。方法提取比格犬BMSCs，全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法行體外分離培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長變化。將生長形態(tài)良好的第3代BMSCs分成兩組，實(shí)驗(yàn)組加入200 ng/m l人BMP-2的含血清培養(yǎng)基對其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組只用含血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，于誘導(dǎo)3周后行堿性磷酸酶染色、誘導(dǎo)4周后行茜素紅染色與Von-Kossa染色以鑒定分化的成骨細(xì)胞。結(jié)果誘導(dǎo)3周后實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶染色示細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒陽性表達(dá)，對照組為陰性;誘導(dǎo)4周后實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色以及Von-Kossa染色均呈鈣結(jié)節(jié)陽性表達(dá)，對照組均為陰性。實(shí)驗(yàn)組染色結(jié)果都表達(dá)成骨細(xì)胞的特性。結(jié)論體外分離培養(yǎng)的比格犬BMSCs，在誘導(dǎo)劑人BMP-2的作用下可以向成骨細(xì)胞定向分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2;成骨分化;骨組織工程

臨床上較多患者因外傷、腫瘤或先天性疾病等原因造成牙槽骨缺損而不能滿足種植修復(fù)的要求，骨組織工程的出現(xiàn)改變了骨缺損患者難種植的局面，且在多年的研究中得到了快速的發(fā)展［1］。組織工程骨由種子細(xì)胞、生物支架和生長因子三部分組成，其不僅能修復(fù)缺損的骨質(zhì)，還能促進(jìn)新生骨的形成。目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是研究較成熟的種子細(xì)胞［2］，它具有干細(xì)胞多向分化的潛能，能在體外培養(yǎng)條件下向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞多向分化［3］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)對BMSCs進(jìn)行成骨定向誘導(dǎo)，在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞的生長形態(tài)變化，通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色以及Von-Kossa染色來評價(jià)誘導(dǎo)細(xì)胞的性質(zhì)，為修復(fù)種植體周圍骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究提供較為理想的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Thermo公司);胎牛血清(美國Hyclone生物制品公司);Human BMP-2(美國Peprotech公司);Motic倒置相差顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)

1.2 BMSCs的分離與培養(yǎng)取1只12月齡健康成年比格犬，雌雄不限，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，0.5 mg阿托品麻醉前15 min注射，3%戊巴比妥(1 m l/kg)行犬股骨外側(cè)肌注麻醉后抽取骨髓10 m l，肝素抗凝，2000 r/min離心10 min，吸取中間白色絮狀單核細(xì)胞層，細(xì)胞以1×108/ml的密度接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，加入3～5 m l DMEM/F12培養(yǎng)基(10%胎牛血+0.1%青鏈霉素)，混勻后于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。原代48 h首次換液，此后每2～3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)生長變化。當(dāng)原代細(xì)胞處于80%～90%融合階段時(shí)，加入胰蛋白酶細(xì)胞消化液，以1:2進(jìn)行消化傳代。

1.3 BMSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)取體外擴(kuò)增且生長活力旺盛的第3代BMSCs，以2×104個(gè)/孔接種于多塊預(yù)先放入細(xì)胞爬片的6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組的6孔板中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(200 ng/ml BMP-2+10%胎牛血+0.1%青鏈霉素)，對照組的6孔板仍用完全培養(yǎng)基(10%胎牛血+0.1%青鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察及記錄細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 堿性磷酸酶染色采用改良鈣鈷法進(jìn)行染色，將實(shí)驗(yàn)組與對照組誘導(dǎo)3周的6孔板的細(xì)胞爬片取出，4%多聚甲醛固定30 min，2%硝酸鈷5 min，1%硫化銨5min，1%中性紅染色1min，沖洗后干燥，封片，顯微鏡下觀察與拍照。

圖1 BMSCs原代48h，細(xì)胞呈短梭形(×100)

1.5 茜素紅染色將誘導(dǎo)4周的實(shí)驗(yàn)組與對照組的6孔板中的細(xì)胞爬片取出，4%多聚甲醛固定30 min，沖洗烘干后浸入新鮮的0.1%茜素紅-Tris-Hcl (pH 4.2)溶液中37℃水浴2 h，沖洗后干燥，封片，顯微鏡下觀察與拍照。

1.6 Von-Kossa染色鑒定取出實(shí)驗(yàn)組與對照組誘導(dǎo)4周后的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，加入現(xiàn)配的2%硝酸銀溶液1 ml，紫外線下面靜置1 h，換用5%硫代硫酸鈉溶液作用1 ml，1%中性紅染色30 min，沖洗干燥后顯微鏡下觀察與拍照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察，成年比格犬BMSCs原代培養(yǎng)48h時(shí)，細(xì)胞呈短梭形或紡錘形，多數(shù)呈單個(gè)貼壁生長分散于大量的雜細(xì)胞中(圖1)。隨著傳代與換液，細(xì)胞得以純化，呈成纖維細(xì)胞樣，且在傳代后細(xì)胞的形態(tài)基本保持不變。傳至第3代時(shí)，細(xì)胞呈長梭型，貼壁及增長速度逐漸加快，生長密集，有一定的方向性，整體呈漩渦狀或螺旋狀排列(圖2)。成骨誘導(dǎo)3周的BMSCs體積增大，形態(tài)可多樣，梭形或多角形，可呈“鋪路石”樣排列，胞質(zhì)內(nèi)可見散在的顆粒狀物質(zhì)及空泡(圖3)。

2.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果堿性磷酸酶是鑒定成骨細(xì)胞的標(biāo)志，主要分布在成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)基質(zhì)小泡的膜上。實(shí)驗(yàn)組染色結(jié)果為陽性，細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見散在分布的黑色顆粒(圖4);對照組呈陰性。

2.3 茜素紅染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈陽性，肉眼可見鈣鹽沉積，鏡下觀察到細(xì)胞外基質(zhì)中散在出現(xiàn)致密不透光的褐色礦化結(jié)節(jié)，中心呈黑色，呈圓形或卵圓形(圖5);對照組呈陰性。

2.4 Von-Kossa染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞誘導(dǎo)4周后，細(xì)胞密集，形成細(xì)胞團(tuán)，有些密集區(qū)域的細(xì)胞可多層重疊，邊界不清，細(xì)胞分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)，并且包裹細(xì)胞形成細(xì)胞結(jié)節(jié)即鈣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心出現(xiàn)基質(zhì)沉積，主要出現(xiàn)在細(xì)胞密集區(qū)，呈黑染(圖6);對照組細(xì)胞呈陰性。

圖2 第3代BMSCs呈長梭形，細(xì)胞排列似漩渦狀(×100)

圖3 BMSCs成骨誘導(dǎo)3周，細(xì)胞排列呈“鋪路石”樣(×100)

圖5 茜素紅染色結(jié)果呈陽性，細(xì)胞聚集區(qū)可見紅褐色的鈣化結(jié)節(jié)(×100)

圖4 堿性磷酸酶染色結(jié)果為陽性，細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見散在分布的黑色顆粒(×100)

圖6 Von-Kossa染色結(jié)果呈陽性，細(xì)胞密集區(qū)有黑色的鈣結(jié)節(jié)形成(×40)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類存在于骨髓基質(zhì)中易于貼壁的紡錘狀的細(xì)胞，由于其取材容易、體外易于分離培養(yǎng)及自體回植、有多向分化潛能等特征，被廣泛作為種子細(xì)胞用于骨組織工程中。目前用于BMSCs體外分離培養(yǎng)的方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞分選法。

全骨髓貼壁法［4］是將提取的骨髓稀釋后直接加培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過換液去除不貼壁的懸浮細(xì)胞使BMSCs純化，該方法簡單但獲取的細(xì)胞純度不高;密度梯度離心法是根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同用細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，此法獲取細(xì)胞的純度較高，但其操作嚴(yán)格不易掌握;免疫磁珠分離法［5］成本較高［6-7］，流式細(xì)胞分選法操作又繁瑣，一般均較少采用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合全骨髓貼壁法與密度梯度離心法來分離細(xì)胞，將提取的骨髓通過離心后因細(xì)胞比重不同而出現(xiàn)分層，其中間的白色絮狀層就是BMSCs所在細(xì)胞層，可直接置于低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，此方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)成本低，對細(xì)胞損傷小，細(xì)胞可快速貼壁并大量增殖，可將細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)快速純化，縮短實(shí)驗(yàn)周期。

BMSCs的多向分化能力導(dǎo)致了我們需要借助特定的誘導(dǎo)劑才能將BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化。近年來，多種誘導(dǎo)劑被參與到實(shí)驗(yàn)研究中，如經(jīng)典的將10-7mol/L地塞米松、10-2mol/Lβ-磷酸甘油和50 mg/L的L-抗壞血酸聯(lián)合起來的含血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以及透明質(zhì)酸［8］、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2［9］(BMP-2)、富血小板血漿(PRP)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子［10］等，其中BMP-2展現(xiàn)出較好的研究應(yīng)用背景，被廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究中。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)最初是從牛的異位骨化結(jié)果中發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種蛋白質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的成員［11］，是一類具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)間葉細(xì)胞成骨分化的因子，以二聚體的形式存在于生物體內(nèi)。BMP-2是BMPs中的一員，很久以來被證實(shí)是成骨誘導(dǎo)能力最強(qiáng)之一，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞不可逆的向成骨細(xì)胞定向分化與增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，通過鈣鹽沉積，參與骨的形成與重建［12-13］，具有高效的異位誘導(dǎo)成骨以及跨種屬誘導(dǎo)成骨作用，但對已分化成熟的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞無生物學(xué)效應(yīng)。Maegawa［14］、Varkey［15］等研究表明BMP-2可以在體外引導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化;張為西等［16］也驗(yàn)證出BMSCs經(jīng)100μg/L BMP-2誘導(dǎo)，ALP活性增高，鈣結(jié)節(jié)形成，分化為成熟的成骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)用人的BMP-2對犬的BMSCs進(jìn)行跨種屬誘導(dǎo)，且以200 ng/m l的有效濃度持續(xù)培養(yǎng)，成功的使BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

ALP是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志之一［17］，在BMSCs骨化過程中發(fā)揮了重要作用，與鈣離子復(fù)合后可以粘附在膠原蛋白上形成礦化物，所以我們不僅可以通過檢測ALP的活性水平來檢測出誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞，也可以直接通過對礦化物的檢測來證明成骨細(xì)胞的存在。本實(shí)驗(yàn)中，無論是ALP染色后細(xì)胞質(zhì)中黑染的顆粒狀物質(zhì)，還是茜素紅染色與Von-Kossa染色后黑色深染的鈣結(jié)節(jié)都證明了這一點(diǎn)，BMSCs已向成骨細(xì)胞分化。

綜上所述，體外分離培養(yǎng)的犬BMSCs在誘導(dǎo)劑BMP-2的作用下可以向成骨細(xì)胞定向分化，可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。

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Experimental study of human BMP-2 on osteogenic induction in BMSCs of dogs in vitro

XU Lei1HAN Jian-guo1LI Jia-feng2
(1.School of Stomatology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China; 2.Dept.of Oral Maxillofacial Surgery，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China)

Objective:To provide seed cells for bone tissue engineering in the late establishment by establishing the culture system of bonemarrow mesenchymal stem cells(BMSCs)of dogs in vitro，and using human BMP-2 to make them induced to differentiate into osteoblasts.Methods:The extraction of BMSCs of adult beagle dogs was made，then the whole marrow adherencemethod and density gradient centrifugation were used to isolate and culture BMSCs in vitro，and observe the cell growth morphology everyday.The third generation BMSCs with good growth form was divided into two groups.The experimental group were cultured with adding 200ng/m l human BMP-2 containing fetal bovine serum(FBS)while the control group were cultured only with completemedium containing FBS.Then we used the detection of alkaline phosphatase staining after 3 weeks＇induction，alizarin red staining and Von-Kossa staining after4 weeks＇induction to identify the differentiation of osteoblasts.Results:After3 weeks of induction of experimental group with alkaline phosphatase，staining showed the cytoplasm of positive expression of black particles，and itwas negative in the control group;After4 weeks of induction ofexperimental group with alizarin red staining and Von-Kossa staining showed positive expression of calcium nodules，and it was negative in the control group.All the staining results in the experimental group showed the characteristics of osteoblasts.Conclusion:BMSCs of dogs，which are extracted and cultivated in vitro，can directionally differentiate into osteoblasts under the action of human BMP-2.

bonemarrow mesenchymal stem cells;BMP-2;osteogenesis differentiation;bone tissue engineering

R780.2

A

1004-7115(2015)09-0971-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.09.001

2015-03-19)

許蕾(1989—)，女，江蘇蘇州人，碩士研究生，研究方向:口腔頜面外科。

韓建國，碩士生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師，主要從事牙體牙髓病學(xué)臨床和基礎(chǔ)研究。