趙文飛 魏紅梅 于華 馬曉燕 趙文文 霍云華 陸月香 張克勤(.青島市中心(腫瘤)醫(yī)院腫瘤綜合二科，山東青島6604; .總裝備部奧林佳苑干休所，北京000;.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州50900)

熱化療對(duì)ARH-77細(xì)胞體外增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究*

趙文飛1魏紅梅1于華1馬曉燕1趙文文1霍云華2陸月香3張克勤3
(1.青島市中心(腫瘤)醫(yī)院腫瘤綜合二科，山東青島266042; 2.總裝備部奧林佳苑干休所，北京1001023;3.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州510900)

目的觀察熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ARH-77細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度變化及凋亡的影響。方法MTT法確定阿霉素的工作濃度，以該濃度進(jìn)行化療或與熱療的聯(lián)合，選擇溫度40℃、41℃及42℃，體外作用于ARH-77細(xì)胞。作用前及48 h采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的存活率;MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用;流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化。觀察熱療聯(lián)合阿霉素的抗腫瘤效果。結(jié)果作用48h IC50的藥物濃度作為實(shí)驗(yàn)的工作濃度。熱化療組對(duì)ARH-77細(xì)胞有明顯的抑制作用(P＜0.01)，隨著溫度的增高而增強(qiáng);熱化療組細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論熱療聯(lián)合阿霉素能增加ARH-77細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率。

熱化療;阿霉素;ARH-77;增敏作用;凋亡

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種惡性腫瘤，多見于中老年人，未經(jīng)治療的中位生存期6個(gè)月，早期無癥狀。全身化療是其主要治療方法，最近，治療方法有了新的思路和進(jìn)展，涌現(xiàn)了一批新藥，如反應(yīng)停及蛋白酶體抑制劑萬珂的出現(xiàn)和干細(xì)胞移植治療方法的不斷完善，使MM的緩解率有了很大提高。MM應(yīng)用化療治療取得緩解后，易復(fù)發(fā)，且大部分病人對(duì)化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥，尋求新的治療方法非常重要。

本研究使用人源多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，觀察了阿霉素(adriamycin，ADM)與熱療聯(lián)合對(duì)ARH-77體外增敏作用的影響，為臨床熱化療聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)耐藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人源多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ARH-77購于湖南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，由我科實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 試驗(yàn)分組試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(單純培養(yǎng))、化療組、熱療組和熱化療組，其中，熱療和熱化療組各分別設(shè)40℃、41℃及42℃3個(gè)溫度，共設(shè)8組。

1.3 熱療方法電熱恒溫水浴箱中加熱60 min，溫度變化±0.2℃。

1.3.1 藥物工作濃度的確定阿霉素設(shè)1、2、4、8、16μg/m l5個(gè)濃度組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率，以48 h IC50的藥物濃度作為試驗(yàn)的工作濃度。IC50的數(shù)值按IC50計(jì)算軟件獲得。

1.3.2 處理方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARH-77細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞密度為5×104/ m l的單細(xì)胞懸液，接種于50 ml的培養(yǎng)瓶中，阿霉素按照上述工作濃度分別加入化療組及熱化療組，對(duì)照組及化療組放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);熱療組及熱化療組即刻放入電熱恒溫水浴箱中按照不同溫度加溫60 min，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h時(shí)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率48 h后取各組細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞數(shù)約為106/m l，分別吸出0.9 ml均勻細(xì)胞液移入EP管中，再加0.1 ml 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液，顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)算公式:細(xì)胞存活率(%)=［活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))］×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖48 h收集各組的ARH-77細(xì)胞接種到8個(gè)96孔板中，每孔200μl (103個(gè)細(xì)胞)，每孔加入MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2000 r/min，離心5 min，離心半徑是17.5 cm，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，在微型震蕩上震蕩5 min，然后將培養(yǎng)板置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，選490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD均值-實(shí)驗(yàn)組OD均值)/對(duì)照組OD均值×100%

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物濃度采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度［1］。試驗(yàn)溫度為42℃，取分組處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARH-77細(xì)胞接種于50 ml的培養(yǎng)瓶中，每瓶細(xì)胞數(shù)為5×105，冷PBS(4℃，pH7.4)洗滌2次，再重懸于冷PBS中，4℃下保存至上樣行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，接受波長(zhǎng)為575 nm。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡48 h后收集各組的ARH-77細(xì)胞，每瓶細(xì)胞數(shù)為2×105，去上清后加入300μl DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶100μg/ml和RNA酶20 u/ml)，輕搖細(xì)胞懸液后于室溫避光保存30 min。每管加入400μl緩沖液混合后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 熱療和化療聯(lián)合作用的觀察根據(jù)Veleriote法［2］判定熱化療聯(lián)合的相互作用類型。協(xié)同作用:［C］＜［E］;相加作用:［C］=［E］;次加作用:［E］＜［C］＜［H］或［E］＜［C］＜［D］;干擾作用:［D］＜［C］＜［H］。其中:［H］為熱療組的細(xì)胞存活率，［D］為化療組的細(xì)胞存活率，［C］為熱化療組的細(xì)胞存活率，［E］為熱化療聯(lián)合的預(yù)估細(xì)胞存活率，［E］=［H］×［D］/100。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單向方差分析(One-way ANOVA)，均數(shù)兩兩比較采用LSD法，方差不齊的組間比較采用Tamhane’s T2法。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素工作濃度的確定MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得1、2、4、8及16μg/m l不同濃度的ADM作用ARH-77細(xì)胞48 h的抑制率分別為(17.9±2.9%)、(25.7± 3.6%)、(37.2±4.1%)、(43.8±5.3%)及(66.3±4.5 %)。ADM對(duì)ARH-77細(xì)胞的IC50為8.16μg/ m l，并以此藥物濃度進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。

2.2 熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)細(xì)胞存活率的影響試驗(yàn)前細(xì)胞存活率均為100%。ARH-77細(xì)胞株在40℃、41℃及42℃三個(gè)溫度下各組存活率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間多重比較采用LSD法，在三個(gè)溫度下細(xì)胞存活率以及各組與對(duì)照組比較，熱化療組與熱療組、化療組相比的情況詳見表1。

2.3 細(xì)胞的抑制率單純40℃、41℃及42℃熱療60 min在48h對(duì)ARH-77細(xì)胞均有抑制作用(P＜0.01);單純ADM組對(duì)ARH-77細(xì)胞也有一定的抑制作用;3種溫度的熱化療組的細(xì)胞抑制率均較熱療組和化療組顯著增高(P＜0.01);42℃的熱化療與40℃的熱化療之間的抑制率有顯著性差異(P＜ 0.01)，42℃與41℃、41℃與40℃的熱化療組之間的抑制率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

2.4 加熱對(duì)細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物濃度的影響利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度的改變。ARH-77結(jié)果如下:對(duì)照組(0.19±0.01)、化療組(4.2±0.3)和熱化療組(7.9±0.1)，熱化療組與化療組、對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡在40℃、41℃及42℃溫度下，48h ARH-77細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn)，熱療組及熱化療組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組有明顯升高(P＜0.01);化療組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。熱化療組的細(xì)胞凋亡率較單純熱療及單純化療的凋亡率均明顯升高(P＜0.01)。上述結(jié)果均隨溫度的增加而增強(qiáng)。詳見表1。

表1 熱療聯(lián)合化療對(duì)ARH-77細(xì)胞存活率、抑制率及凋亡率的分析(%

表1 熱療聯(lián)合化療對(duì)ARH-77細(xì)胞存活率、抑制率及凋亡率的分析(%

注:*P＜0.01，與對(duì)照組相比;ΔP＜0.01，★P＜0.05，與阿霉素組相比;#P＜0.01，★P＜0.01，與相同溫度的單加熱組相比。

ARH-77單培養(yǎng)組阿霉素單加熱組加熱+阿霉素40℃41℃42℃存活率100±0 72.9±2.7*85.4±3.0*76.0±3.5*65.4±3.9*60.1±3.9*Δ#49.0±3.5*Δ#36.5±2.2*Δ#40℃41℃42℃抑制率-46.0±2.4 27.9±3.8 36.3±3.1 47.4±1.9 54.5±3.3★63.6±3.7Δ#75.9±3.2Δ#凋亡率4.9±0.9 35.3±3.0*27.0±3.1*35.2±4.2*43.8±2.6*53.5±3.4*Δ#64.7±2.8*Δ#76.3±2.8*Δ#

2.6 熱療和化療聯(lián)合作用的觀察根據(jù)Veleriote法判定熱療與化療聯(lián)合的相互作用類型，詳見表2。

表2 Veleriote法判斷熱療與阿霉素聯(lián)合對(duì)ARH-77細(xì)胞的影響(細(xì)胞存活率均值，%)

表2 Veleriote法判斷熱療與阿霉素聯(lián)合對(duì)ARH-77細(xì)胞的影響(細(xì)胞存活率均值，%)

注:*P＜0.01，與熱化療組相比;ΔP＜0.01，與熱化療組相比。

協(xié)同作用ARH-77 40℃41℃42℃化療組熱療組熱化療組預(yù)估值作用類型72.9±1.3*85.4±2.1Δ60.1±1.2 62.3±2.1協(xié)同作用72.9±1.1*76.0±1.8Δ49.0±1.3 72.9±1.5*協(xié)同作用65.4±2.1Δ36.5±2.0 55.4±2.2 47.7±2.1

3 討論

目前造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后差，在兒童及35歲以下的成人中居第一位。其傳統(tǒng)治療包括化療、放療、生物制劑和骨髓移植等治療。雖然取得較大的療效，但對(duì)復(fù)發(fā)難治及耐藥的惡性血液病，目前缺乏有效的治療方法?；熓蔷C合治療的重要組成部分，如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療的總體效率是治療中亟待解決的問題。目前熱療被譽(yù)為腫瘤治療學(xué)中繼手術(shù)、放療、化療、免疫治療后的第5種治療腫瘤的新手段。

3.1 熱療增加化療敏感性的作用機(jī)制熱療結(jié)合化療殺傷癌細(xì)胞的機(jī)理比較復(fù)雜，可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)［3-4］。(1)高溫對(duì)生物膜有影響:高熱破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使細(xì)胞膜的通透性增加，易于藥物進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)并維持胞漿內(nèi)較高的藥物濃度，增強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)，加重DNA損傷，影響損傷DNA的修復(fù)［5］。(2)高熱可使細(xì)胞膜乏氧:無氧酵解增加，導(dǎo)致癌細(xì)胞的pH值降低，某些藥物在酸性環(huán)境下活性增強(qiáng)，殺傷力提高［6］。(3)熱療可以減少或防止癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性:有實(shí)驗(yàn)證明耐藥細(xì)胞加熱后對(duì)化療敏感性又明顯提高。(4)熱療使化療具有定向性:由于腫瘤組織血液供應(yīng)的特點(diǎn)，瘤體中心血供差，多為乏氧細(xì)胞，對(duì)放療、化療不敏感，而周邊部血供豐富，對(duì)化療敏感，從而達(dá)到原藥物濃度達(dá)不到的效果。近年來，熱療和化療聯(lián)合應(yīng)用在基礎(chǔ)和臨床方面的研究取得了可喜成果。大量研究證明，熱療可以有效增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，兩者具有協(xié)同作用［7-8］。有研究證明，加熱42℃、2h可使某些化療藥物細(xì)胞毒性增強(qiáng)10～100倍，常溫下細(xì)胞毒性較弱的化療藥物在加熱后殺傷能力成倍增加［9］。

3.2 ADM對(duì)熱療的影響ADM是腫瘤細(xì)胞有絲分裂S期非特異性阻滯藥物，主要作用機(jī)制是在DNA復(fù)制過程中誘導(dǎo)TOPOII抑制劑—DNA斷裂物復(fù)合物的形成，引起細(xì)胞死亡或停滯于S期，G2期［10］。由于ADM使大量細(xì)胞處于S期，S期對(duì)熱最敏感［11］，因此先化后熱對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)。ADM對(duì)熱療具有增敏作用，有研究表明，加熱前后細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度有一定變化［12］。張洪新等［13］試驗(yàn)結(jié)果亦顯示:加熱后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度均較加熱前提高顯著，說明加熱是通過增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物濃度來提高其對(duì)化療敏感性的。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，從本實(shí)驗(yàn)可以看出，化療組及熱療組對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，各熱化療組的抑制率與對(duì)照組、熱療組及化療組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，作用強(qiáng)度隨溫度升高而增強(qiáng);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡表明:加熱可以使腫瘤凋亡率增加，熱化療組與其他各組相比有顯著差異(P＜0.01)，并隨溫度增加凋亡率增加。42℃加熱后，K562細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度均較加熱前顯著提高，提示加熱可能是通過增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ADM的藥物濃度來提高其細(xì)胞毒作用的。目前對(duì)于熱化療的作用機(jī)制有了一定的研究，但有關(guān)熱化療對(duì)多藥耐藥影響的報(bào)道不多，熱化療逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的分子生物學(xué)機(jī)制研究也不夠深入.并從分子水平闡述了熱化療降低腫瘤細(xì)胞耐藥性的可能機(jī)制，熱療是否也通過其他途徑產(chǎn)生抗腫瘤耐藥作用日前正在研究之中。為熱化療的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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Thermotherapy enhanced sensitivity ofm ultip lem yelom a cell line ARH-77 to chem otherapy in vitro

ZHAOWen-fei1WEIHong-mei1YU Hua1MAXiao-yan1ZHAOWen-wen1HUO Yun-hua2LU Yue-xiang3ZHANGKe-qin3
(1.Dept.of Oncology，Qingdao Central Hospital，Qingdao 266042;2.Cadre Relaxation Club of the General Armaments Department，Beijing 100101;3.Dept.of Oncology，F(xiàn)ifth Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510900，China)

Objective:To observe the effectof thermotherapy on the intracellular adriamycin concentration and apoptosis of ARH-77 cells in vitro.Methods:The working concentration of adriamycin against ARH-77 was determined by MTT assay.ARH-77 cells were subjected to thermotherapy(at40℃，41℃，42℃)and chemotherapy with adriamycin alone or in conjunction，and the cell survival rates were determ ined at48h after the treatment.The cell growth inhibition effect of the treatmentwas evaluated with MTT assay，and the apoptosis rates of ARH-77 and alteration of intracellular adriamycin concentration were determ ined by flow cytometric analyses.Results:The IC50 of adriamycin was defined as the working concentration in the experiment.The thermotherapy at 40，41 and 42℃for 60 min in conjunction with chemotherapy significantly inhibited the growth of ARH-77 cells(P＜0.01).The results of flow cytometric analyses showed that thermotherapy and adriamycin chemotherapy，used either alone or in conjunction，obviously increased the apoptosis rates of ARH-77 cells (P＜0.01)and thermotherapy remarkably increased the intracellular concentration of adriamycin.Conclusion:Adriamycin chemotherapy combined thermotherapy for 60min can increase the intracellular concentration of adriamycin and the apoptosis rates of ARH-77 cells.

thermochemotherapy;adriamycin;ARH-77 cells;sensitization;apoptosis

R73-3

A

1004-7115(2015)09-0967-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.09.001

2015-04-08)

CSCO-先聲抗腫瘤血管靶向治療科研基金(Y-S2014-016，省級(jí))。

趙文飛(1982-)，醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤內(nèi)科的治療工作。

張克勤(1964-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事熱化療治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究及惡性腫瘤的生物治療。E-mail: gczhkq@163.com。