李昊月，馮 琳，李瑞海，賈天柱

18個(gè)不同產(chǎn)地蒺藜藥材中蒺藜皂苷元的HPLC含量測(cè)定

李昊月，馮 琳，李瑞海*，賈天柱

目的 采用HPLC法測(cè)定蒺藜中蒺藜皂苷元(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)的含量。方法 采用色譜柱Welch Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(80∶20)；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果 蒺藜皂苷元對(duì)照品在0.82～7.38 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)，平均回收率為99.3%，RSD=1.67%(n=6)。結(jié)論 所建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蒺藜藥材的含量測(cè)定。18個(gè)產(chǎn)地的蒺藜樣品中以內(nèi)蒙產(chǎn)的蒺藜皂苷元含量最高。

蒺藜；皂苷元；含量測(cè)定；高效液相色譜法

0 引言

蒺藜為蒺藜科蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果實(shí)。具有平肝解郁，活血祛風(fēng)，明目，止癢之功效，臨床常用于頭痛眩暈，胸脅脹痛，乳閉乳癰，目赤翳障，風(fēng)疹瘙癢[1]。蒺藜在我國有著悠久的用藥歷史，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，歷代醫(yī)家對(duì)其多有論述和應(yīng)用，目前為臨床常用藥，并被收載入我國藥典?，F(xiàn)代研究證明，蒺藜皂苷類成分具有治療心腦血管疾病等作用。本文以蒺藜皂苷元(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)為對(duì)照品，用HPLC對(duì)蒺藜進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，適用于蒺藜的含量測(cè)定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(美國)，安捷倫色譜工作站，紫外檢測(cè)器；KQ3200超聲波清洗器(江蘇昆山)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，SF-130B高速粉碎機(jī)(上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司)，鼓風(fēng)恒溫干燥箱(沈陽市醫(yī)療器械廠)，十萬分之一電子天平(德國電子天平)。

1.2 試藥 蒺藜皂苷元對(duì)照品(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)(本實(shí)驗(yàn)室分離純化，純度99.1%)；不同產(chǎn)地蒺藜藥材經(jīng)鑒定均為符合藥典要求；高效液相色譜用水為蒸餾水，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷元的含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 Welch Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(80∶20)，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃[2]。

2.1.2 供試品溶液制備 取蒺藜藥材，粉碎，精密稱取1 g，加甲醇10 mL，加熱回流處理3次，每次1 h。過濾，合并濾液，蒸干。加甲醇轉(zhuǎn)移并定容至10 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱定蒺藜皂苷元(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)對(duì)照品適量，配成0.123 mg/mL，備用。

2.1.4 測(cè)定結(jié)果 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL。依次進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。

2.2 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取苷元對(duì)照品20.5 mg，以甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，分別精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，分別量取20 μL，注入HPLC色譜儀中，記錄結(jié)果，按上述色譜條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=264.947 X-8.693，r=0.999 7，結(jié)果表明，苷元在0.82～7.38 μg范圍內(nèi)其濃度和峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。峰面積的RSD值為1.07%，表明儀器精密度良好。

圖1 HPLC圖譜

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品14號(hào)分別于0、2、4、6、8、10進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果RSD值為1.29%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品14號(hào)6份，按“2.1.2”項(xiàng)樣品處理，測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果RSD值為0.96%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取蒺藜樣品14號(hào)1 g，加1.23 mg/mL對(duì)照品1 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果RSD值為1.67%，表明方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 各個(gè)產(chǎn)地蒺藜藥材含量測(cè)定結(jié)果 見表2。

表2 蒺藜的產(chǎn)地及蒺藜皂苷元的含量(mg/g)

3 討論

3.1 在提取方法的選擇中，在溶劑選擇上分別采用甲醇、氯仿、石油醚及乙醇回流后鹽酸回流[3]進(jìn)行對(duì)比，在提取方法上采用超聲、加熱回流和索式提取不同提取時(shí)間進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，以甲醇熱回流提取含量較高。

3.2 有報(bào)道，測(cè)定蒺藜皂苷元的含量多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[4]。本研究曾采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[5]和紫外檢測(cè)器203 nm進(jìn)行對(duì)比，均有較好的色譜結(jié)果。而且結(jié)果顯示蒺藜皂苷元在紫外檢測(cè)條件下，色譜峰對(duì)稱，分離度良好，由于紫外檢測(cè)器應(yīng)用廣泛，方便，故本研究采用紫外檢測(cè)器。

3.3 從18個(gè)不同產(chǎn)地蒺藜藥材的測(cè)定結(jié)果看，測(cè)定的樣品均含有蒺藜皂苷元(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)，其中以內(nèi)蒙產(chǎn)的蒺藜含量最高(2.29 mg/g)。各產(chǎn)地含量相差較大，其原因除與產(chǎn)地不同有關(guān)以外，還可能和各藥材中有生品及炮制品有關(guān)，而炮制品中也有炒制顏色深淺、有無刺的區(qū)別。本研究結(jié)果也表明其中生品中蒺藜皂苷元含量較低，而經(jīng)炮制后有較大的提高。本試驗(yàn)為蒺藜藥材制定合理的炮制方法和質(zhì)量控制方法等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 張健,李俊,莫琪,等.蒺藜提取物的藥理研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥研究,1998,14(6):56-57.

[2] 李瑞海.中藥蒺藜活性成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:234-235.

[4] 祁海宏,王春,嚴(yán)偉民.高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)測(cè)定蒺藜皂苷1的含量[J].中國藥事,2006,20(3):158-159.

[5] 李瑞海,馮琳.不同產(chǎn)地蒺藜藥材中蒺藜皂苷元的HPLC-ELSD含量測(cè)定[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,11(10):155-156.

關(guān)于投稿的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求

Determination of the content ofTribulusterrestrissaponin from 18 different areas by HPLC

LI Hao-yue，F(xiàn)ENG Lin,LI Rui-hai*,JIA Tian-zhu

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

Objective To determine the content inTribulusterrestrissaponin(25R-Spirostan-4-ene-3,12-dione)by HPLC method.Methods Welch Ultimate LP-C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the mobile phase consisted of methanol-water(80∶20),the detection wavelength was 203 nm,column temperature was 30 ℃;the flow rate was 1.0 mL/min,sample volumn was 20 μL.Results It showed a good linear relationship with the peak area in 0.82～7.38 μg(r=0.999 7),the average recovery was 99.3%,RSD=1.67%(n=6).Conclusion The method is sensitive,accurate,reproducible,and can be used for determination of the content of theTribulusterrestris.The highest content in the 18 areas is from Inner Mongolia

TribulusterrestrisL.;Saponin;Determination of content;HPLC

2014-06-13

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201501019