陳寅生侯春林*魏長征韓帥

羥 丁 基 殼 聚 糖 的 生 物 相 容 性 研 究*

陳寅生1侯春林1*魏長征2韓帥1

目的研究新型溫敏性生物材料羥丁基殼聚糖的生物安全性，初步探討該材料植入體內(nèi)有無毒副作用。方法將殼聚糖進(jìn)行羥丁基化制備出溫敏性水凝膠，選用小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞，通過MTS法、倒置顯微鏡觀察等方法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗。通過SD大鼠尾緣靜脈浸提液注射，進(jìn)行急性毒性試驗，通過新西蘭兔耳緣靜脈浸提液注射及皮內(nèi)浸提液注射，進(jìn)行致熱原反應(yīng)試驗及皮內(nèi)刺激試驗。結(jié)果 羥丁基殼聚糖無細(xì)胞毒性，不引起試驗動物體溫升高，無皮膚刺激反應(yīng)，急性毒性試驗不引起試驗動物死亡或者其它不適。結(jié)論 羥丁基殼聚糖材料生物相容性好，是一種安全的生物材料，有望作為新型藥物載體應(yīng)用于臨床。

羥丁基殼聚糖；溫敏性；生物相容性

1 引言

近幾十年以來，在生物醫(yī)用研究中，由于高含水量、高膨脹性等特性，水凝膠引起了人們的高度重視。其中原位凝膠更是受到許多研究的青睞，它可以提供一種簡單的治療和診斷手段。高分子溶液通過聚合、化學(xué)交聯(lián)、離子交聯(lián)或受到外部環(huán)境的變化如溫度、pH、離子強(qiáng)度等，在與原位形成凝膠。其中溫敏性凝膠作為一種智能凝膠成為生物材料的研究熱點。溫敏性凝膠主要有一下幾個特性和有優(yōu)點，如操作方便具有可注射性;凝膠化過程中不需要加入其的化學(xué)交聯(lián)劑和其他復(fù)雜操作進(jìn)而提高了材料的生物安全性和相容性。

本課題組在國內(nèi)率先研制了基于殼聚糖的溫敏性材料，即通過對殼聚糖進(jìn)行羥丁基化改性，制備具有溫敏特性的羥丁基殼聚糖 (Hydroxybutyl chitosan,HBC)，大量的前期研究表明羥丁基殼聚糖凝膠具有良好的溫度響應(yīng)性，即低溫下為流動的液體，而在生理溫度下轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z，且該過程為可逆過程。同時我們在國際上首次探討了其生物醫(yī)用研究，結(jié)果顯示其具有良好的預(yù)防術(shù)后組織粘連、腦脊液封堵以及止血等生物學(xué)功能。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本文主要探討羥丁基殼聚糖的生物相容性，主要從細(xì)胞毒性、生物相容性等方面探討了羥丁基殼聚糖的生物安全性，即選用小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞，通過細(xì)胞增殖度檢測、倒置顯微鏡觀察等方法，為進(jìn)一步應(yīng)用提供必要的實驗數(shù)據(jù)和安全性依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗動物

健康 SD大鼠 (清潔級，第二軍醫(yī)大學(xué)動物房)10只，6～8周；新西蘭白兔 (普通級，第二軍醫(yī)大學(xué)動物房)12只雌性 (未生產(chǎn)過)或雄性，體重2.0～2.2kg。

2.2 試驗材料

HBC凝膠 (自制)；L929細(xì)胞株 (博谷生物有限公司)；MTS試劑 (Promega公司)；以下來自長征醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心：DMEM；胰酶；苯酚；新生牛血清；甲醛；5%CO2培養(yǎng)箱(A-006，德國)；倒置熒光顯微鏡(CKX41)；酶標(biāo)儀(ST-360)。

2.3 細(xì)胞毒性試驗

將HBC凝膠放入DMEM培養(yǎng)液中，以1:4比例 (1單位體積HBC凝膠比4單位體積培養(yǎng)基)在37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱下浸提24小時，吸取浸提上清液作為100%浸提液。再將100%浸提液用DMEM培養(yǎng)液稀釋為25%、50%和75%浸提液。復(fù)蘇L929細(xì)胞，提前進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用胰酶消化洗脫培養(yǎng)的L929細(xì)胞，將生長狀態(tài)良好的1×104/mL的L929細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入50 L細(xì)胞懸液，分別加入HBC凝膠25%、50%、75%、100%浸提液100 L/孔，陰性試驗組加DMEM培養(yǎng)液100 L/孔，陽性試驗組加含0.5%苯酚的細(xì)胞培養(yǎng)液100 L/孔。每組設(shè)10孔平行對照。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于1、2、4天，分別各取出1塊96孔板放在倒置顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞生長情況后，于每孔加入 MTS試劑（5mg/mL）20 L，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度值。根據(jù)檢查OD值計算各組細(xì)胞相對增值率(relativegrowthrate,RGR)。RGR=試驗組吸光度均值/陰性對照組吸光度均值×100%。

根據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)國家評價標(biāo)準(zhǔn)[4]評定材料毒性程度：0級：RGR≥100%；1級：RGR為75%～99%；2級：RGR為50%～74%；3級：RGR為25%～49%；4級：RGR為1%～24%；5級：RGR為0%。0～1級為合格；2級可結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、生長密度分析后綜合評價；3～5級為不合格。

2.4 急性全身毒性試驗

健康SD大鼠隨機(jī)分成試驗組、對照組各5只。試驗組取大鼠尾緣靜脈，注射生理鹽水HBC凝膠浸提液50mL/kg，速度為0.1mL/s，對照組以相同速度注射生理鹽水。記錄注射前、1、2、3、4、5、7天大鼠的體重。并每日觀察SD大鼠的毒性反應(yīng)、活動狀態(tài)、體重變化和死亡情況。

2.5 致熱原反應(yīng)試驗

新西蘭兔7只，以2.5mL/kg的劑量通過耳緣靜脈注射，打入HBC浸提液，觀察新西蘭兔0.5、1、1.5、2、3小時的體溫情況，通過肛門測量新西蘭兔的體溫，試驗時避免刺激、驚嚇動物，以免干擾體溫測量結(jié)果。

2.6 皮膚刺激試驗

新西蘭兔5只，試驗前24小時將HBC凝膠以1：4的比例放入0.9%的生理鹽水，室溫下浸提24小時，抽取上清液，即為HBC凝膠100%浸提液。另將新西蘭兔背部去毛，兩側(cè)各形成5cm×20cm試驗區(qū)。在新西蘭兔背部取4個點，分別標(biāo)記為1、2、3、4四個注射點，在每個注射點分別用1mL注射器注射0.2mL待測液，1號注射點皮內(nèi)注射100% HBC浸提液，2號注射點皮內(nèi)注射50%HBC浸提液，3號注射點皮內(nèi)注射4%甲醛溶液 (陽性對照)，4號注射點皮內(nèi)注射0.9%的生理鹽水(陰性對照)，注射后20分鐘、1小時、24小時觀察記錄注射后皮膚改變情況。根據(jù)表1記錄皮內(nèi)刺激反應(yīng)評分和數(shù)字等級。[4]

表1 皮內(nèi)刺激反應(yīng)評分和數(shù)字等級

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性試驗通過24、48、96小時的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HBC浸提液，在24小時后，25%浸提液可明顯促進(jìn)L929細(xì)胞的生長，50%浸提液可相對促進(jìn)L929細(xì)胞生長，75%浸提液、100%浸提液也可輕微促進(jìn)L929細(xì)胞的生長。在48小時后，陰性對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，陽性對照組細(xì)胞死亡明顯，25%浸提液組出現(xiàn)L929細(xì)胞凋亡，50%、75%、100%浸提液及陰性對照組細(xì)胞生長均良好。在96小時后，100%浸提液、75%浸提液組細(xì)胞增殖相對陰性對照組增強(qiáng)，25%浸提液組明顯抑制 L929細(xì)胞生長，細(xì)胞進(jìn)一步凋亡，陽性對照組細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)模糊、僅保留細(xì)胞輪廓，具體結(jié)果如下表2。

表2 各濃度浸提液組不同細(xì)胞培養(yǎng)時間細(xì)胞相對增值率及毒性分級

96小時100%浸提液組/陰性對照組 117.8319 116.0647 99.41847 14.53526 9.088578 4 75%浸提液組/陰性對照組0 0 50%浸提液組/陰性對照組1 25%浸提液組/陰性對照組4陽性對照組/陰性對照組

以下為48小時后，高倍光鏡下各組 L929細(xì)胞培養(yǎng)照片 (彩圖見插頁):

3.2 急性全身毒性試驗注射后1～7天分別觀察注射生理鹽水組與注射HBC浸提液組，發(fā)現(xiàn)所有大鼠均無死亡，亦無驚厥、抽搐、食欲減退、呼吸抑制等毒性反應(yīng)。注射完即刻，大鼠出現(xiàn)輕度煩燥不安，注射生理鹽水組第2天體重降至注射前體重，第3日體重明顯增加。注射HBC浸提液組第2天體重未恢復(fù)到注射前，從第4天體重開始正常增加，4～7天體重增加情況與陰性對照組無差異。以上述結(jié)果表明，HBC浸提液急性毒性試驗為陰性。

3.3 致熱原反應(yīng)試驗

表3 新西蘭兔藥物注射后體溫變化如下

將HBC浸提液通過耳緣靜脈打入新西蘭兔體內(nèi)，分時段測量其肛溫，發(fā)現(xiàn)注射前后體溫變化未超過±1℃，HBC浸提液不會引起新西蘭兔體溫升高，致熱原反應(yīng)試驗陰性。

3.4 皮膚刺激試驗 (表4)

24小時后100%HBC浸提液組、50%HBC浸提液組及陰性對照組皮丘均消失，外觀和正常皮膚組織無差別，無發(fā)紅、發(fā)白、水腫等不良反應(yīng)，陽性對照組皮膚發(fā)生大小不等的干性壞死、蒼白缺血，說明 HBC浸提液對皮膚無刺激，皮內(nèi)刺激試驗陰性。

表4 皮膚刺激反應(yīng)評分和數(shù)字等級結(jié)果如下

4 討論

殼聚糖 (CS)是一種堿性氨基多糖，具有無生物毒性、生物體可降解性、良好的黏附性和生物相容性等特點[5]。通過將殼聚糖羥丁基化后，不僅使其水溶性得到顯著改善，使難溶于水的殼聚糖能溶解于水，而且創(chuàng)新性的引入了溫敏性的屬性，溫度范圍在20～34℃之間時可轉(zhuǎn)變?yōu)樗z[6]。溫敏型水凝膠是一種研究最多、應(yīng)用最廣的高分子水凝膠，其體積能隨溫度變化而變化，其特征是有一個臨界的凝膠溫度，聚合物鏈在這個溫度下由于疏水作用而自發(fā)組裝，發(fā)生相互分離。傳統(tǒng)的溫敏型水凝膠多以丙烯酰胺為原料，該物質(zhì)具有一定的毒性且降解困難，使用時可能會給影響環(huán)境。天然大分子化合物殼聚糖具有較高的可降解性、對環(huán)境無污染等優(yōu)點。因此，殼聚糖原性水凝膠引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

對于植入體內(nèi)的羥丁基殼聚糖水凝膠是否對生物體有害，須首先檢測其生物相容性。細(xì)胞生物相容性評價是測生物材料毒性的手段，具有簡便、敏感性高、性評價的一項重要內(nèi)容，已被廣泛應(yīng)用于生物相容性評價。近年來常用MTS (新型甲臜化合物)替代MTT法檢測細(xì)胞毒性[7]。與MTT相比，MTS可直接進(jìn)行比色，試驗步驟簡便，也大大提高了試驗的敏感性，并且避免了添加二甲亞砜對細(xì)胞的不良影響。本試驗選用小鼠成纖維細(xì)胞 (L929)，L929細(xì)胞是細(xì)胞毒性試驗中應(yīng)用最早及使用最廣泛的細(xì)胞[8]。從L929細(xì)胞毒性試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)陰性對照組和高濃度HBC浸提液組，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)4天過程無細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)良好，生長正常。但是低濃度浸提液組及25%浸提液組細(xì)胞生長數(shù)量在第一個24小時后明顯多于陰性對照組及高濃度浸提液組。48小時后，通過倒相差顯微鏡觀察，25%浸提液組細(xì)胞大小明顯變小，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)變少，細(xì)胞生長明顯被抑制。第3天之后細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保留。陽性對照組的 L929細(xì)胞如預(yù)期一樣，全部死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，陰性對照組的細(xì)胞和高濃度浸提液組細(xì)胞如預(yù)期一樣，生長良好。唯獨25%浸提液 (低濃度)組細(xì)胞第1天生長加快，第2天出現(xiàn)凋亡，這一點與試驗預(yù)期不同。分析原因可能是HBC作為一種新型殼聚糖衍生物，同樣也具有傳統(tǒng)殼聚糖"抑制成纖維細(xì)胞生長[9]"這一屬性。劉萬順等研究殼聚糖復(fù)合物膜可抑制成纖維細(xì)胞生長并預(yù)防肌腱粘連[10]，殼聚糖及其衍生物被制作成防粘連膜應(yīng)用于外科手術(shù)中，療效明顯[11,12]?？梢酝茰yHBC作為殼聚糖的新型衍生物同樣可以在低濃度狀態(tài)下誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，并且具有輕度防粘連的作用。假設(shè)HBC本身有細(xì)胞毒性，應(yīng)該是浸提液濃度越高，細(xì)胞死亡越快，正好與試驗結(jié)果相反，故假設(shè)不能成立，從而證明HBC無細(xì)胞毒性。

急性中毒試驗意在檢測 SD大鼠 LD50劑量，但由于HBC為膠體狀，通過尾緣靜脈注射無法大量注入膠體，故改為注射浸提液。浸提液中HBC溶解度較低，需要大量浸提液體注入大鼠體內(nèi)方可將一定量的 HBC注入，故按照50ml/kg的比例注射大鼠尾緣靜脈注射。如在短時間將內(nèi)此劑量液體注入人體后，可引起循環(huán)功能衰竭，在大鼠試驗中未觀察到水中毒或其他毒性反應(yīng)，但如將膠體凝膠注入大鼠體內(nèi)，恐會引起靜脈栓塞，故本試驗由于給藥方式的限制，無法測出大鼠的半數(shù)致死劑量。

皮膚刺激試驗的目的是評價材料在試驗條件下產(chǎn)生刺激反應(yīng)的潛在性。刺激是不涉及免疫學(xué)機(jī)制的一次、多次或持續(xù)與試驗材料接觸所引起的局部炎癥反應(yīng)。在小動物體上進(jìn)行的皮膚刺激試驗有助于鑒別出人體皮膚和/或黏膜組織的潛在刺激物。一種原發(fā)性刺激物的特性是可產(chǎn)生炎癥直接反應(yīng)，即導(dǎo)致皮膚炎癥病變或是重度刺激、皮膚水泡和/或壞死癥狀。大量使用家兔的皮膚刺激試驗資料證實，家兔為優(yōu)選試驗動物。

通過以上試驗，未得出羥丁基殼聚糖水凝膠有生物毒性的陽性結(jié)果，故可認(rèn)為HBC水凝膠是一種生物相容性良好、安全可靠的新型溫敏性水凝膠。

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The study of the biocompatibility of the Hydroxyl butyl chitosan

ChenYinsheng1,Hou Chunlin1,Wei Changzheng2,et a1.1 Department of Orthopaedics,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai,200003;2 Shanghai Qisheng Biological Agent Co.,Ltd.,Shanghai, 200003,China

Objective Tomake the bio-safetyassessmentof anew thermosensitive material,namedhydroxybutyl chitosan ,and to investigate the toxic and side effect of the material in vivo.Methods We hydroxyl butyl the chitosan into thermosensitive hydrogel,and use mouse embryonic fibroblast,L929.inverted microscope to observe the outcome of the experiment.Trailing edge intravenous injection of SD rats was done to complete acute toxicity test.Leach liquor was injectedinto NewZealandRabbitsearveinsto completethermaltest.Leach liquor was injectedintoNewZealand Rabbits skins to complete skin irritation test.Results All tests show that hydroxybutyl chitosan has no cytotoxicity,no skin irritation.It doesn't cause a high body temperature.Acute toxicity test find no animals dead or discomfort.Conclusion Hydroxybutyl chitosan has good biocompatibility.As a safe biomaterial,it will hopefully become a new drug carrier.

Hydroxybutyl chitosan;Thermosensitivity;Thermosensitivity

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.03.004

swgk2015-02-0024

*課題項目：國家863課題(2014AA093606)

l第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海200003；2上海其勝生物制劑有限公司，上海200003