馬金萍，楊 輝

1沙嶺子醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075000，2河北北方學(xué)院藥學(xué)系

剪刀股總黃酮的提取與含量測定*

馬金萍1，楊 輝2△

1沙嶺子醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075000，2河北北方學(xué)院藥學(xué)系

目的：建立剪刀股總黃酮的提取與含量測定方法。方法：通過正交試驗(yàn)優(yōu)化剪刀股總黃酮最優(yōu)提取條件，采用分光光度法對剪刀股總黃酮的含量進(jìn)行測定。結(jié)果：剪刀股總黃酮含量為3.16%，樣品平均回收率為97.5%,RSD為3.86%。結(jié)論：分光光度法測定剪刀股總黃酮含量，方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

剪刀股；正交試驗(yàn)；總黃酮；含量測定

剪刀股(Ixeris debilis A.G ray)是菊科苦荬菜屬植物剪刀股全草，別名鴨舌草、鵝公英，具有清熱涼血、利尿消腫之功效。用于肺熱咳嗽、喉痛、口腔潰瘍、急性結(jié)膜炎、闌尾炎、水腫、小便不利；外用治乳腺炎、瘡癤腫毒、皮膚瘙癢等[1]。相關(guān)文獻(xiàn)[2]報(bào)道剪刀股提取物可對抗煙堿引起的致癌作用。目前，對剪刀股化學(xué)成分的研究報(bào)道較少。本研究對剪刀股總黃酮的提取及含量測定方法進(jìn)行探討，以期為剪刀股藥用價(jià)值的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 剪刀股采自河北省張家口市，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。KQ-2500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R E 52C S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；U V759紫外-可見分光光度計(jì)（上海精科）；D Z F-688型真空干燥箱（寧波江南儀器廠）；S F-400型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[3]精密稱取120℃干燥3小時(shí)至恒重的蘆丁對照品13.4 m g，置50 m L量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得濃度為0.268 m g/m L的對照品溶液。精密吸取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 m L，分別置25 m L量瓶中，加水至6m L，加5%亞硝酸鈉溶液1m L，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1 m L，搖勻，放置6分鐘，加4%氫氧化鈉溶液10m L，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘；在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度(C)對吸光度(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度3個(gè)因素，并各設(shè)置三個(gè)水平，以總黃酮含量為測定指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化總黃酮提取工藝，見表1。

表1 正交試驗(yàn)影響因素與水平

將剪刀股洗凈，待控干水分后，于45℃恒溫干燥箱烘干至質(zhì)量恒定，粉碎為粗粉。準(zhǔn)確稱取剪刀股粗粉9份，各5 g，按照正交設(shè)計(jì)方案的條件進(jìn)行超聲波提取，同法再超聲提取2次，合并濾液濃縮至干，用70%乙醇轉(zhuǎn)移至50m L容量瓶中，定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2m L，用70%乙醇定容于25m L容量瓶中作為供試品溶液。取供試品溶液2m L分別置25m L量瓶中，照“1.2.1”項(xiàng)下方法操作，在波長510 nm處測定吸光度。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取相同供試品溶液5份，每份2 m L，分別于室溫放置0、15、30、45、60 min后，依法測定吸光度。

1.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 同一批樣品5份，每份5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液，精密吸取2m L，依法測定并計(jì)算含量。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取相同供試品溶液2 m L，加水至6 m L，按“1.2.1”項(xiàng)下方法操作，于510 nm波長處連續(xù)5次測定吸光度。

1.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取重現(xiàn)性試驗(yàn)所用的同批樣品（已知含量3.16%）約5 g，共5份，精密稱定，加入適量的蘆丁對照品，按供試溶液制備方法制備溶液，依法測定吸光度。

1.2.7 含量測定 稱取剪刀股粗粉3份，各5 g，依據(jù)所選最佳條件，提取總黃酮并進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁濃度(C)對吸光度(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為：A=12.996C+ 0.0018（r=0.999 6）。結(jié)果表明，當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為0.0000～0.0536 m g/L時(shí)，其質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 超聲提取剪刀股總黃酮的最佳工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶20，乙醇濃度為70%，提取120 min。結(jié)果表明，從剪刀股提取總黃酮以液料比影響最大，其次為提取時(shí)間，乙醇濃度影響最小，見表2-3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 平均吸光度為0.266，R S D=3.23% (n=5)，表明供試品溶液在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 平均含量為3.18%，R S D=2.38% (n=5)，表明方法重現(xiàn)性好。

2.5 精密度試驗(yàn) 平均吸光度為0.263，R S D=0.15% (n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn) 平均回收率為97.5%，R S D =3.86%，表明方法具有良好的加樣回收率。

2.7 含量測定 含量測定結(jié)果見表4。

表4 含量測定

3 討論

通過正交試驗(yàn)，優(yōu)選了剪刀股總黃酮的提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表明剪刀股總黃酮最佳提取工藝條件為料液比為1∶20，乙醇濃度為70%，提取120分鐘。3種因素對黃酮提取率的影響順序?yàn)锳＞C＞B，在該最佳提取工藝條件下，總黃酮提取率達(dá)到2.9237%。

黃酮類化合物含量測定方法有比色法[4]、分光光度法[5-6]等。本研究選用分光光度法并以A l (N03)-N a N02-N a0H系統(tǒng)為顯色劑測定剪刀股中黃酮的含量。通過方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，此法操作簡單，并具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜谥兴幓蛱烊划a(chǎn)物中黃酮含量的測定。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:881.

[2] 蒲明秋,毛飛鵬.蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)-剪刀股對抗煙堿引起遺傳物質(zhì)損傷的誘變效應(yīng)[J].中國慢性病預(yù)防與控制, 1995,3(2):89.

[3] 張軍武,趙琦,王昌利.不同生長年限黃芪中黃芪甲黃的含量考察[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(3):30-31.

[4] 郭亞健,范莉,王曉強(qiáng),等.關(guān)于NaNO2-AI(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志,2002,22(2):97-99.

[5] 秦民堅(jiān),吉文亮,王崢濤.鳶尾不同產(chǎn)地、采收期總黃酮的含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18(4):23-25.

[6] 方圓,王雪彥,晁若冰.土茯苓藥材中落新婦苷和總黃酮的含量測定方法研究[J].藥物分析雜志,2010,30(9):1738-1741.

Extraction and ContentDeterm ination of Total Flavonoids in JianDaoGu

MA Jinping1,YANG Hui2△
1 Pharmacy Departmentof ShalingziHospital,Zhangjiakou 075000,China; 2 College of Pharmacy of Hebei North University

Objective:To establish the extractionmethodsand contentdeterm ination of total flavonoids in Jian－DaoGu(Ixeris japonica).Methods:The extraction conditions of total flavonoids in JianDaoGu were optimized by orthogonal design,and the contents of total flavonoids in JianDaoGu were detected by spectrophotometricmethod.Results:The contentsof total flavonoids in JianDaoGu occupied 3.16%,average recovery rate of the sampleswere 97.5%, RSD was3.86%.Conclusion:Determ inationmethod of total flavonoids in JianDaoGu by spectrophotometricmethod is simple,accurateand reproducible.

JianDaoGu;orthogonaldesign;total flavonoids;contentdetermination

R657.3

A

1004-6852(2015)07-0027-03

2014-10-25

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號 Z 2013006）。

馬金萍（1970—），女，主管藥師。研究方向：中藥臨床研究。

△通訊作者：楊輝（1972—），男，副主任藥師。研究方向：中藥化學(xué)研究。