李廣雷，楊 薇，林青華，魏雅蕾，昶國(guó)平，劉博翾，張宏桂△

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2北京悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司

枸杞子的提取工藝研究*

李廣雷1，楊 薇2，林青華1，魏雅蕾1，昶國(guó)平1，劉博翾1，張宏桂1△

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2北京悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司

目的：優(yōu)選枸杞多糖的最佳提取工藝條件。方法：以枸杞子中枸杞多糖含量和枸杞多糖干膏得率為指標(biāo)，用硫酸-苯酚顯色分光光度法測(cè)定其含量，用正交實(shí)驗(yàn)法L9(34)對(duì)實(shí)驗(yàn)提取料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)3個(gè)因素進(jìn)行考察，確定枸杞多糖的最佳提取工藝，并對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：以枸杞中枸杞多糖含量和枸杞多糖干膏得率為指標(biāo)，最佳提取工藝為A3B2C3。結(jié)論：由于提取次數(shù)從2次增加到3次后多糖的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)增幅不是很大，考慮到成本的原因，確定最佳的工藝條件為A3B2C2，即料液比為1:20，回流時(shí)間為1小時(shí)，提取次數(shù)為2次。

枸杞子；多糖；提取工藝

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果實(shí)，其藥理作用與所含枸杞多糖(L B P)有關(guān)[1-7]。枸杞多糖是水溶性成分。本文采用水回流提取枸杞，以浸膏得率和枸杞多糖為指標(biāo)，采用向量歸一化法，優(yōu)化提取工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 UV-2100紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥 枸杞藥材購(gòu)自北京圣惠堂中藥飲片有限公司，批號(hào)12100906，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系張貴君教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞的果實(shí)。葡萄糖對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)所；苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.3 方法 原料用水浸泡0.5小時(shí)后，回流提取L B P，研究料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），確定最佳的工藝條件。

表1 L9（34）枸杞多糖提取試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)表

1.3.1 多糖的含量測(cè)定，硫酸-苯酚法[8]

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.005 0 g于50mL容量瓶中，加水溶解定容至刻度，配制成0.1m g/mL的葡萄糖溶液；精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL，置于10mL具塞試管中，加水補(bǔ)至2mL，再精密加入1mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10分鐘，置40℃水浴中保溫15分鐘，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白溶液，在490 n m的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.1.2 多糖含量測(cè)定 精密吸取供試液1mL，置于具塞試管中，測(cè)定方法同“1.3.1.1”，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算濃度，按下式計(jì)算多糖含量（%）=3.17C×D/W，式中C為測(cè)定的枸杞多糖樣品用標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出的以葡萄糖為測(cè)定結(jié)果的含量；W為枸杞干果的質(zhì)量（m g)；D為枸杞多糖的稀釋因素，在操作中D=80 000；3.17為葡萄糖換算成枸杞多糖的換算系數(shù)[9]。

1.3.2 料液比的選擇實(shí)驗(yàn) 在確定提取時(shí)間為1小時(shí)，提取次數(shù)為1次的情況下，選擇料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:30，根據(jù)其浸膏得率和多糖含量選擇合適的料液比。

1.3.3 回流時(shí)間的選擇實(shí)驗(yàn) 在確定料液比為1:15的條件下，分別回流提取0.5、1、1.5、2、3小時(shí)，回流提取1次，根據(jù)其浸膏得率和多糖含量選擇合適的料液比。

1.3.4 提取次數(shù)的選擇實(shí)驗(yàn) 在確定料液比為1:15、回流1小時(shí)的條件下，分別回流提取1、2、3、4、5次，根據(jù)其浸膏得率和多糖含量選擇合適的料液比。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取已于60℃烘干并粉碎的枸杞子20 g，加入圓底燒瓶中，按設(shè)計(jì)好的正交實(shí)驗(yàn)條件回流提取，提取液濃縮，濃縮至60 mL，比重約為1.1～1.2，精密吸取30mL濃縮液至已稱(chēng)重的蒸發(fā)皿中，先水浴蒸干，然后烘干（105℃）3小時(shí)，至恒重，稱(chēng)量，計(jì)算得干膏收率；另精密吸取濃縮液15mL，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，加入6倍量95%乙醇，攪拌均勻，4℃靜置過(guò)夜，棄去上清液，沉淀經(jīng)干燥得粗品L B P，再準(zhǔn)確精密加入200mL水溶解，取10mL置于250mL容量瓶中，定容，得供試品溶液。平行進(jìn)行2次正交實(shí)驗(yàn)，以減少隨機(jī)誤差的出現(xiàn)，見(jiàn)表2-3。

表2 枸杞多糖正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

表3 方差分析

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：Y=69.36X+0.0738，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，式子中Y為吸光度，X為濃度（m g/mL），線(xiàn)形范圍為0.002 5-0.012 5m g/mL。2.2 單因素考察實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn) 隨著加水量的不斷增加，多糖的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)也逐漸增加。當(dāng)加水量增加到20倍以后，評(píng)價(jià)指數(shù)增幅不大，所以正交試驗(yàn)選擇1:10、1:15、1:20三個(gè)水平。見(jiàn)表4。

表4 料液比對(duì)多糖提取的影響

2.2.2 回流時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)也逐漸增加。當(dāng)回流時(shí)間延長(zhǎng)到1.5小時(shí)，評(píng)價(jià)指數(shù)增幅不大，所以正交試驗(yàn)選擇0.5、1、1.5三個(gè)水平。見(jiàn)表5。

表5 回流時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

2.2.3 提取次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn) 隨著提取次數(shù)的增多，多糖的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)也逐漸增加。當(dāng)回流次數(shù)增加到3次時(shí)，評(píng)價(jià)指數(shù)增幅不大，所以正交試驗(yàn)選擇1、2、3三個(gè)水平。見(jiàn)表6。

表6 提取次數(shù)對(duì)多糖提取的影響

2.3 回流提取正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：提取次數(shù)（C）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最大，其次是料液比（A）和回流時(shí)間（B）。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝條件為A3B2C3，但是由于提取次數(shù)從2次增加到3次后多糖的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)增幅不是很大，考慮到成本的原因，確定最佳的工藝條件為A3B2C2，即料液比為1∶20，回流時(shí)間為1小時(shí)，提取次數(shù)為2次。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照以上結(jié)果分析的最佳工藝，分別各取3批樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較和驗(yàn)證最佳提取工藝的可靠性。通過(guò)表7可以看到最佳的工藝條件下所得到的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)比任何一次正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果都良好。因此可以說(shuō)明本提取工藝研究所得結(jié)果具有很高的可靠性。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在單因素實(shí)驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定了用水回流提取枸杞多糖的最佳工藝，不僅節(jié)約了成本還可以為工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。通過(guò)本工藝的提取，枸杞多糖的提取率可達(dá)到13.5%，可為保健食品和藥品生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

加入硫酸顯色之后，不同的時(shí)間點(diǎn)，樣品吸光度不同，在經(jīng)過(guò)考察之后發(fā)現(xiàn)，加入硫酸10分鐘后，在40℃水浴中保溫15分鐘，拿出立即在冷水中放涼，此方法顯色所得吸光度值穩(wěn)定性較好。

在回流時(shí)間的單因素考察中發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總的干膏量逐漸增加，但是多糖的含量在2小時(shí)達(dá)到最高，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化導(dǎo)致多糖含量減低。

在醇沉淀多糖的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入4倍量的95%的乙醇后，沉淀靜置過(guò)夜，再加入95%乙醇仍然有沉淀，這與加入4倍量的95%的乙醇的文獻(xiàn)[10]給出的參考不同，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入6倍量后可完全沉淀多糖。

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Study on Extraction Technology of GouQ iZi

LIGuanglei1,YANGWei2,LIN Qinghua1,WEIYalei1,CHANG Guoping1,LIU Boxuan1,ZHANG Honggui1△
1 College of Chinese Medicine of Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing100102,China; 2 Youcare Pharmaceutical Group Company Limited

Objective:To optim ize the extraction technology of GouQiZi (Lycium barbarum L.) polysaccharide.Methods:By taking the contents of GouQiZi polysaccharide and dry extract yield of GouQi polysaccharide as the indexes,the contents weremeasured by sulphuric acid-phenol reagent spectrophotometry,the extraction ratio ofmaterial to liquid(A),extraction time(B)and extraction times(C)were investigated by orthogonal testmethod L9 (34)to confirm the optimum extraction technology of GouQi polysaccharide,and then to verify the optimalprocess.Results:W ith the contentsof GouQi polysaccharide and dry extractyield of GouQi polysaccharide as the indexes,the optimum extraction technologywasA3B2C3.Conclusion:Since theextraction increases from tw ice to three times,comprehensive evaluation indexes isn't large,by taking the cost into account,the optimal extraction technology is A3B2C3,whichmeans thatmaterial-liquid ratio is 1:20,reflux time is 1h and the extraction times are tw ice,extraction timesare tw ice.

GouQiZi;polysaccharide;extraction technology

R285.1

A

1004-6852(2015)08-0018-03

2014-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào): 31070328）。

李廣雷（1989—），男，碩士學(xué)位。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：張宏桂(1955—)男，博士學(xué)位，教授。研究方向：中藥化學(xué)有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。