李靜平，李慶生，祁 燕

1云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2昆明醫(yī)科大學(xué)；3云南省中醫(yī)院

“膚敏”膏對(duì)大鼠PCA模型T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響

李靜平1，李慶生2，祁 燕3

1云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2昆明醫(yī)科大學(xué)；3云南省中醫(yī)院

目的:研究“膚敏”膏對(duì)大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)（PCA）模型T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響，探討其抗皮膚過(guò)敏作用機(jī)理。方法:用卵白蛋白建立大鼠PCA模型，采用免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PCA大鼠外周血CD3＋T、CD4＋T和CD8＋T細(xì)胞表達(dá)率及“膚敏”膏對(duì)3種細(xì)胞的影響作用。結(jié)果:與模型組比較，“膚敏”膏3劑量組CD3＋T和CD4＋T細(xì)胞表達(dá)率均值較模型組明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論:“膚敏”膏的作用機(jī)理可能與其調(diào)節(jié)CD3＋T、CD4＋T的數(shù)量紊亂有關(guān)，從而間接的干預(yù)Th1/Th2細(xì)胞分化及平衡,在過(guò)敏反應(yīng)早期調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡以阻斷病變進(jìn)程。

大鼠PCA模型；T淋巴細(xì)胞及亞群；“膚敏”膏

“膚敏”膏是云南省名中醫(yī)李慶生教授在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和科研工作中總結(jié)、結(jié)合文獻(xiàn)篩選確定的治療過(guò)敏性皮膚病的有效中成藥制劑。筆者在完成新藥臨床前各項(xiàng)系統(tǒng)研究并獲肯定藥效學(xué)資料的基礎(chǔ)上,開(kāi)展“膚敏”膏的治療作用機(jī)理及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)探索，為該中藥復(fù)方制劑的深層次研發(fā)奠定工作基礎(chǔ)。

C D3+T細(xì)胞分子可表達(dá)所有成熟T細(xì)胞，即代表所有成熟T細(xì)胞。而在成熟T細(xì)胞表面可分為C D4+T和C D8+T細(xì)胞兩個(gè)亞類。C D4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可引起一系列皮膚炎癥發(fā)生，而C D4+T細(xì)胞進(jìn)一步分為T h1和T h2兩細(xì)胞亞群，后者合成和分泌大量細(xì)胞因子進(jìn)而吸引炎癥細(xì)胞趨向局部。故T h1/T h2細(xì)胞平衡失調(diào)是誘發(fā)過(guò)敏性皮膚病的重要因素。而C D4+T細(xì)胞為T h1/T h2細(xì)胞分化的前體細(xì)胞，C D4+T/C D8+T細(xì)胞平衡直接影響后續(xù)T h1/T h2細(xì)胞平衡。藥物能否干預(yù)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞（C D3+T細(xì)胞）及其亞群細(xì)胞（C D4+T/C D8+T細(xì)胞）的數(shù)量、功能及比例，使這種失衡重新回到平衡,無(wú)疑是從根本上有效治療本病的關(guān)鍵新舉措。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠P CA模型，觀察不同劑量“膚敏”膏對(duì)T h1、T h2細(xì)胞分化的前體細(xì)胞C D3+T、C D4+T細(xì)胞的影響，進(jìn)而反映“膚敏膏”對(duì)皮膚過(guò)敏細(xì)胞免疫功能紊亂的影響，揭示該中成藥作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 S P F級(jí)S D大鼠，體質(zhì)量200～300g，雌雄兼用，由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：S C X K(川)2012-16。

1.1.2 試劑 卵白蛋白（E gg A l b u m i n）：Si g ma進(jìn)口分裝，由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司分裝，批號(hào) A-5378。FI T C a n t i-rat C D3，P E a nt i-rat C D4，P E a n t i-rat C D8，R B C裂解液，P B S洗滌液均為美國(guó)B i o l e g e n d公司原裝進(jìn)口。地塞米松：昆明振華制藥廠生產(chǎn)，0.75m g/片，批號(hào)120417。

1.1.3 儀器 FAC S Va n ta g e S E型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司生產(chǎn)），S P X-250BZ電子恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)），T GL-20M高速臺(tái)式離心機(jī)（上海第三儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PCA（被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)）模型的建立[1]大鼠抗血清制備：雄性大鼠，180～220 g，每側(cè)大腿肌肉注射1%卵白蛋白0.5mL，同時(shí)腹腔注射5%氫氧化鋁凝膠0.1mL。14天后取血，2000 r p m離心10分鐘，制備大鼠抗卵白蛋白血清，置低溫冰箱保存。注：氫氧化鋁凝膠制備：稱取適量氯化鋁，加少量生理鹽水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)p H至8即可。大鼠同種P CA：除正常組外，其余各組大鼠背部皮內(nèi)注射1∶2稀釋的抗血清，0.1mL/點(diǎn)，共2點(diǎn)，24小時(shí)后，按10mL/kg的給藥容積靜脈注射2%卵白蛋白溶液攻擊。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為低、中、高劑量“膚敏”膏組，陽(yáng)性組（地塞米松）、模型組和正常組。灌胃給藥劑量依次為1.04，2.07，7.24，0.00041g/kg,模型組和正常組均給予同體積生理鹽水。灌胃1次/d，連續(xù)5天。除正常組外，各組大鼠于第5天分別背部皮內(nèi)注射稀釋的抗血清致敏，24小時(shí)后靜脈注射2%卵白蛋白溶液進(jìn)行攻擊，30分鐘后大鼠用3.5%的水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血 2~3mL，肝素鈉充分抗凝，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞及其亞群。

1.2.3 T淋巴細(xì)胞（CD3+T細(xì)胞）及其亞群（CD4+T、CD8+T細(xì)胞）測(cè)定[2]采用免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞及其亞群。1）每只動(dòng)物分別取2份各100μL的抗凝全血置于2個(gè)流式管中，每管中分別加入FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D4和FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D8，進(jìn)行熒光標(biāo)記。2）將上述各管避光、2~8℃孵育30分鐘。3）取出各管分別加入R B C裂解液2 mL，使紅細(xì)胞充分裂解至管內(nèi)液體澄清透亮為止。離心（100 r/m i n），棄上清液。4)各管分別用1.5 mL P B S液洗滌2~3次，離心，棄上清液。5）各管加入200~ 300μL P B S液，充分彈開(kāi)細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。6）流式細(xì)胞儀檢測(cè)條件及參數(shù)采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FAC S Va n ta g e S E型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15m W氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為 488 n m，應(yīng)用C E LL Q u est進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。檢測(cè)前以f l ow-c h ec k F l u or p h eres(10u m)熒光微球（R E F 6605359 B ec k e n Co u l ter，I n c f u l l erto n，CA 92835）作為標(biāo)本樣品，調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用S P SS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，符合正態(tài)分布組間采用A N OVA分析，方差齊者組間進(jìn)行L S D-t檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行T am h a n e’s T2檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的組間采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常組比較，造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T細(xì)胞表達(dá)率均值明顯降低，差異具有顯著性意義（P＜0.01）；而C D8+T細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)給藥后，與模型組比較，“膚敏膏”低、中、高3劑量組C D3+T和C D4+T細(xì)胞表達(dá)率均值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C D8+T細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響%

3 討論

C D3+T細(xì)胞可代表所有成熟T細(xì)胞。而在成熟T細(xì)胞表面可分為C D4+T和C D8+T細(xì)胞兩個(gè)亞類。即輔助性T細(xì)胞（T h）和抑制性T細(xì)胞（T s）。C D4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可引起組織以淋巴細(xì)胞（主要是T細(xì)胞）和單核吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的滲出性炎癥發(fā)生。致敏后各種炎癥細(xì)胞和活性因子引起血管擴(kuò)張、管壁通透性增強(qiáng)，形成濕疹樣病變，表現(xiàn)為紅斑、丘疹、水皰等一系列皮膚炎癥反應(yīng)。同時(shí)C D4+T細(xì)胞進(jìn)一步分為T h1和T h2兩細(xì)胞亞群，它們合成和分泌大量細(xì)胞因子如IL-2、4、6、10，IF N-γ、T N F-β、L T等，進(jìn)而吸引炎癥細(xì)胞趨向局部。所以C D4+T細(xì)胞為T h1/T h2細(xì)胞分化的前體細(xì)胞，C D4+T/C D8+T細(xì)胞平衡直接影響后續(xù)T h1/T h2細(xì)胞平衡[3-4]。故進(jìn)行C D3+T、C D4+T、C D8+T細(xì)胞含量測(cè)定以反映“膚敏膏”對(duì)皮膚過(guò)敏細(xì)胞免疫功能紊亂和T h1/T h2細(xì)胞分化的前體細(xì)胞的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T細(xì)胞表達(dá)率均值明顯降低，（P＜0.01）。C D8+T細(xì)胞有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C D4+T/C D8+T比值與正常對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.05），這與鄧丹琪[3]的研究結(jié)果一致，反映出模型動(dòng)物存在細(xì)胞免疫功能紊亂。經(jīng)“膚敏膏”低、中、高3劑量組治療后，大鼠C D3+T和C D4+T細(xì)胞表達(dá)率均值不同程度升高（P＜0.05）；C D8+T細(xì)胞有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，我們認(rèn)為“膚敏膏”的作用機(jī)理可能與其調(diào)節(jié)C D3+T、C D4+T細(xì)胞平衡有關(guān)，通過(guò)對(duì)其數(shù)量紊亂的糾正作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能以間接的干預(yù)T h1/T h2細(xì)胞分化及平衡,在過(guò)敏反應(yīng)早期調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡以阻斷病變進(jìn)程。從而阻斷過(guò)敏性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展，從根本上改善過(guò)敏體質(zhì)，以達(dá)消敏、抗敏作用。

[1] 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：1196-1200.

[2] 曾秋妹，潘祥龍.中藥抗炎一號(hào)注射液治療急性皮炎濕疹對(duì)T細(xì)胞亞群影響[J].福建醫(yī)藥雜志，2001，23（5）：3-5.

[3] 鄧丹琪.濕疹的皮膚實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞免疫功能的觀察[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，1998，11（12）：42-43.

[4] Bel linghausen I,Brand U.Comparsion of al lergen stimulated dendritic f rom atopic and nonatopic donors dissecting their ef fect on autologous nave and memory T helper cel ls of such donors[J].J Al lergy Clin Immunol,2000,105（4）:988-996.

The Influenceof FuM in Ointm enton T Lym phocytesand ItsSubsets of PCA RatModel lym phocyte

LIJingping1,LIQingsheng2,QIYan3
1 Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China;2 Kunming Medical University；3 Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore themechanism of FuM in ointment fighting against skin allergic reaction by studying itseffectson T lymphotesand itssubsetsof passive cutaneousanaphylaxis(PCA)ratmodel.Methods:PCA ratmodelwas established w ith ovalbumin,expression rates of CD3+T,CD4+T and CD8+T in peripheral blood of PCA ratswere detected by immunofluorescent flow cytometry and the effectsof FuM in ointmenton three kindsof cells.Results:Compared with themodel group,three groups of FuM in ointmentwere higher than themodel group in CD3+T, CD4+T and CD8+T cellular expression rates average values obviously(P＜0.05).Conclusion:Themechanism of FuM in ointmentmightbe related to its function of regulating CD3+T and CD4+T quantity disorder indirectly,therefore,to intervene Th1/Th2 cells differentiation and balance,regulating cellular immunity balance in allergic reaction in order to cease pathologicalprogress.

PCA ratmodel;T lymphotesand its subsets;FuM in ointment

R285.5

A

1004-6852(2015)08-0006-03

2014-10-25

李靜平(1979—)女，博士學(xué)位，講師。研究方向：臨床中藥學(xué)。