史艷梅，魏 攀，陳媛媛，楊 冉，金立鋒，劉萍萍，李 鋒，屈凌波,4，林福呈，王 燃*

1．鄭州大學化學與分子工程學院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)科學大道100號 450001

2．中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

3．中原工學院理學院，河南省新鄭市龍湖鎮(zhèn)淮河路1號 451191

4．河南工業(yè)大學化學化工學院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號 450001

煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析

史艷梅*1,2，魏 攀*2，陳媛媛3，楊 冉1，金立鋒2，劉萍萍2，李 鋒2，屈凌波1,4，林福呈2，王 燃**2

1．鄭州大學化學與分子工程學院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)科學大道100號 450001

2．中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

3．中原工學院理學院，河南省新鄭市龍湖鎮(zhèn)淮河路1號 451191

4．河南工業(yè)大學化學化工學院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號 450001

為揭示煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）基因的功能，采用同源克隆的方法從普通煙草（Nicotianatabacum）中克隆了NtZDS基因，并進行了遺傳進化分析。同時通過熒光定量PCR技術分析NtZDS的時空表達模式、利用煙草脆裂病毒誘導的基因沉默（VIGS）體系抑制本氏煙草中ZDS基因的表達，在該基因沉默后再通過定量PCR技術分析NtZDS上下游基因的表達量變化，并檢測了煙株色素含量的變化。結果顯示：NtZDS基因在普通煙草中至少存在兩個同源拷貝，其編碼序列與番茄、馬鈴薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在煙草盛花期的葉和花中表達量最高。與對照比較，該基因沉默后，煙株新生葉片出現嚴重白化現象，能夠為VIGS體系提供一個良好的候選報告基因；同時類胡蘿卜素合成通路其他基因的表達量和煙株類胡蘿卜素、葉綠素含量都顯著降低，表明ZDS基因在煙草生長發(fā)育及類胡蘿卜素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

煙草；ζ-胡蘿卜素脫氫酶；基因；克?。槐磉_模式；病毒誘導的基因沉默

在高等植物中，類胡蘿卜素主要存在于葉片的葉綠體及花和果實中，具有吸收和傳遞電子的能力，并在清除光合作用產生的葉綠素自由基方面具有重要的作用［1］。同時，類胡蘿卜素是植物激素脫落酸（ABA）的前體物，可促進ABA的生物合成，增強植物的各種抗逆反應能力［2］。因此，對類胡蘿卜素的生物合成進行研究具有重要意義。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-Carotene desaturase，ZDS）是類胡蘿卜素生物合成過程中的關鍵酶之一，主要參與植物體內線狀類胡蘿卜素的生物合成。ZDS基因目前已從無花果、小麥、番木瓜、辣椒、擬南芥、番茄、草莓、甘薯、黃瓜、柿子和黃水仙等植物中分離出來，其cDNA全長1.8～2.lkbp，編碼558～574個氨基酸［3-5］。胡重怡等［6］從栽培煙草韭菜坪2號中克隆出ZDS的cDNA全長序列，并對其編碼蛋白的一級、二級結構進行了預測。表達枸杞和龍膽ZDS基因的轉基因煙草花中β-胡蘿卜素含量提高49%，葉片中的提高91%［7］，說明ZDS基因與類胡蘿卜素的合成密切相關。Rodrigo等［8］在柑橘中對類胡蘿卜素合成相關基因進行表達模式分析，發(fā)現ZDS基因和八氫番茄紅素合成酶（PSY）基因表達量上調，有利于線性類胡蘿卜素的合成，對柑橘果實顏色形成有重要貢獻。綜上所述，在多種植物中ZDS基因與類胡蘿卜素的合成緊密相關。然而煙草中類胡蘿卜素是一種重要的顯色物質和香味前體物，與煙葉的外觀色澤和感官品質關系密切［9］，在煙葉成熟及烘烤過程中對改善煙葉香氣品質和保持香氣風格具有重要作用［10］。但煙草中ZDS是否對類胡蘿卜素的合成有重要影響尚未見報道。因此，克隆了普通煙草ZDS基因的編碼區(qū)序列，并分析了該基因的時空表達模式，同時研究了ZDS基因下調情況下對煙草植株的生長發(fā)育及代謝物的影響，旨在明確煙草ZDS基因在類胡蘿卜素通路中的作用，為選育優(yōu)良煙草品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于表達模式分析的普通煙草紅花大金元（紅大）種植于云南省玉溪市研和鎮(zhèn)大田，分別采集苗床期、伸根期、旺長期、現蕾期、盛花期和不打頂移栽后70 d的煙草葉片、莖稈、須根和花。本氏煙草由鄭州煙草研究院國家煙草基因研究中心于溫室中栽培，栽培條件為溫度（23±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，光暗交替，相對濕度（60±2）%［11］。

RNA反轉錄試劑，克隆載體試劑盒pMDR19-T Simple Vector，大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，DL2 000 DNA Marker，DL10 000 DNA Marker，SolutionⅠ連接酶及各種限制性內切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。RNA提取和DNA純化試劑盒及SYBR Green熒光染料購自德國QIAGEN公司。PCR試劑購自北京全式金生物技術有限公司。由生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成并測序。

1.2 方法

1.2.1 煙草RNA的獲取

取普通煙草和本氏煙草植物組織樣品，用液氮研磨成粉，按照RNA提取試劑盒說明書步驟進行RNA提取，經Agilent2100檢測RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

根據NCBI網站普通煙草序列（KC484705.1）設計ZDS基因上下游引物，上游引物ZDS-F為5’-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3’，下游引物ZDS-R為5’-TCAGACAAGACTCAACTCATCA GATAC-3’。將克隆得到的紅大ZDS編碼區(qū)序列與其他物種的進行比對，找出保守區(qū)域，利用保守區(qū)域設計病毒誘導ZDS基因沉默引物，上游引物ZDS-VIGS-F為5’-ATGGATCCATCCTGTCGCATA TGCTCTTGGA-3’（包含KpnⅠ酶切位點），下游引物為5’-CACTCGAGGAGGCATGTAAGGGTCACC AGGT-3’（包含XhoⅠ酶切位點）。ZDS基因沉默后定量PCR檢測引物序列見表1中ZDS-Q-F和ZDS-Q-R。

表1 類胡蘿卜素通路定量PCR所用引物及序列

1.2.3 ZDS基因編碼區(qū)全長的克隆

根據反轉錄試劑盒說明書將煙草RNA反轉錄成cDNA作為模板，體系20μL，其中：RNA模板1μg，5×反轉錄緩沖液4μL，dNT Ps（10mmol/L）4μL，RNA酶抑制劑20U，Oligo（dT）18引物50pmol，AMV反轉錄酶10U，用DEPC處理過的水加至20μL，然后用ZDS基因的特異性引物進行擴增。PCR反應體系及反應條件見表2和表3。PCR結束后，純化PCR產物，純化后DNA片段連接T載體，然后轉化DH5α感受態(tài)，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上進行篩選培養(yǎng)，挑取白色單菌做菌落PCR驗證，選2～3個陽性菌進行測序。

1.2.4 遺傳進化分析

用鄰接法（Neighbor-joiningmethod）和MEGA 5.0軟件對植物的ZDS核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹，進化樹中的數字代表計算頻率值，重復檢驗1 000次。

1.2.5 TRV2-ZDS重組載體的構建和農桿菌轉化

以克隆出的ZDS1基因為模板，用病毒誘導基因沉默引物擴增保守區(qū)域，PCR反應條件如表3（延伸時間為35 s），PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后純化回收?；厥盏腪DSVIGS目的片段和pTRV2（pYL156）載體均使用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，反應體系：PCR回收產物（或pTRV2載體）2μg，KpnⅠ（10 U/μL）和XhoⅠ（10 U/ μL）各2.5μL，10×Buffer 5μL，加水至50μL。37℃酶切4 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化雙酶切產物，并連接轉化。菌落PCR驗證得到陽性菌，提取質粒，用KpnⅠ和XhoⅠ對質粒進行雙酶切驗證并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表2 PCR反應體系

表3 PCR反應條件

將構建成功的質粒通過液氮凍融法轉化農桿菌GV3101。分別取pTRV1、pTRV2、pTRV-ZDS和pTRV-PDS質粒1μL，加入含0.1m L的GV 3101農桿菌感受態(tài)細胞的EP管中，冰上放置30m in；將含有該質粒的農桿菌感受態(tài)細胞放入液氮速凍1min，然后37℃溫育5m in；加入900μL LB液體培養(yǎng)基，28℃懸浮振蕩培養(yǎng)3 h；5 000 r/min離心1m in，棄去上清液，加入200μL LB液體培養(yǎng)基，重懸沉淀；取200μL重懸液（即轉化產物）均勻地涂于含25μg/m L利福平和50μg/m L卡那霉素的LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d；挑取適量的轉化菌斑PCR鑒定無誤后，搖菌注射本氏煙草的煙苗。

1.2.6 農桿菌侵染

利用注射接種的方法進行農桿菌侵染［11］，分別將pTRV1、pTRV2、pTRV2-ZDS和pTRV2-PDS陽性菌接種于含相應抗生素的5m L LB培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜。吸出0.2m L菌液接種于20mL LB培養(yǎng)基［含10 mmol/L 2-N-嗎啉基乙磺酸（MES）和20μmol/L乙酰丁香酮（AS）］中，28℃過夜培養(yǎng)。離心（4 000 r/min，30 s）收集上述菌體，然后重懸在LB培養(yǎng)基（含10mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES+200μmol/L AS）中，調OD600為1.0，室溫靜置3 h。以不注射為空白對照，pTRV1&pTRV2為陰性對照（TRV），pTRV1& pTRV2-PDS為陽性對照（TRV-PDS），pTRV1& pTRV2-ZDS為實驗組（TRV-ZDS），每組中兩種菌液按1∶1比例混合，分別注射煙草。

1.2.7 熒光定量PCR

利用SYBR Green染料法在普通煙草中定量分析ZDS基因的時空表達模式，同時分析農桿菌侵染本氏煙草后類胡蘿卜素合成相關基因的表達量差異，采用26SrRNA為內參基因。熒光定量PCR體系為：1μL cDNA模板（50 ng/μL），10μL SYBR Green染料（2×SYBR Green），ZDS（或26S）基因上下游引物各1μL（5μmol/L），無RNA酶的水7μL。PCR反應條件采用兩步法：94℃5m in；94℃20 s，60℃20 s，40個循環(huán)；4℃，停止。

PSY、PDS和CRTISO等與類胡蘿卜素合成相關的基因表達量分析所用的引物見表1，熒光定量PCR體系和條件同1.2.3節(jié)的ZDS基因。選取代表性的3株煙草樣品進行分析，每個樣品重復檢測3次，取Cp值的平均值，用2-△△CT法計算。

1.2.8 煙草色素含量測定

稱取干燥煙草葉片樣品200mg，25m L 90%丙酮超聲萃取20min，過濾取上清液，液相色譜檢測煙草色素含量（質量分數）。色譜條件：色譜柱為反相C18液相色譜柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為3.9mm×150mm，4μm粒徑，或相當型號色譜柱。進樣量：10μL，流速：0.5m L/min。檢測波長：448 nm和428 nm。流動相A：異丙醇。流動相B：80%乙腈水溶液。

1.2.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理和單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 NtZDS基因編碼區(qū)（CDS）的克隆及分析

以ZDS-F和ZDS-R為引物，從cDNA模板中PCR擴增ZDS基因的CDS序列，PCR產物電泳結果顯示在1 000～2 000 bp之間出現較亮的特異條帶，見圖1。純化目的片段，連接T載體，進行陽性克隆驗證，大量挑取陽性菌進行隨機測序。結果發(fā)現兩條相似度為96.02%的NtZDS基因序列，一條序列CDS全長為1 785 bp（命名為NtZDS1），另一條CDS全長是1 767 bp（命名為NtZDS2）。序列比對見圖2，結果表明普通煙草體內NtZDS基因至少存在兩個拷貝。Blast結果顯示兩條序列與馬鈴薯和番茄的ZDS基因的相似度均高于90%。

圖1 NtZDS編碼區(qū)序列的PCR電泳圖

不同植物ZDS核苷酸序列進化樹分析結果見圖3。結果表明，NtZDS1和NtZDS2分別與作為父母本煙草的絨毛狀煙草和林煙草聚為一支，NtZDS1源于林煙草基因組，NtZDS2源于絨毛狀煙草基因組，林煙草和絨毛狀煙草雜交加倍的過程中各貢獻了1個ZDS基因同源拷貝，因此在栽培煙草體內至少存在有兩個拷貝。同時，在ZDS基因進化樹中，雙子葉植物和單子葉植物（擬南芥除外）各聚為一支，ZDS基因屬于雙子葉植物的茄科，與同屬茄科的番茄、馬鈴薯聚為一支，表明該基因與茄科植物的親緣關系很近。

圖2 NtZDS1和NtZDS2兩序列比對

2.2 NtZDS基因時空表達模式分析

NtZDS基因在栽培煙草紅大各個發(fā)育時期和各器官中的轉錄水平表達模式分析見圖4。結果顯示，NtZDS基因在各個時期的葉片中表達量最高，尤其是嫩葉（第15位葉片），在現蕾期和盛花期葉中表達量達到頂峰，在盛花期煙株花中表達量顯著提高，這可能與β-胡蘿卜素的積累及花的顯色相關。根部的表達量最低，轉錄水平表達模式的研究結果表明，該基因與植物的生理狀態(tài)密切相關，在煙株光合作用較強的幼嫩組織中表達量較高，其生物學功能可能與光合生理過程存在密切的關系。

2.3 NtZDS基因VIGS重組載體的構建及驗證

ZDS基因在普通煙草體內存在相似度達96.02%的兩個拷貝，進行分別的沉默難度大，因此采用VIGS技術對該基因進行共同沉默。以克隆得到的ZDS1編碼區(qū)基因全長質粒為模板，用ZDS-VIGS-F&-R擴增VIGS片段保守區(qū)域，對應于CDS的782～1 414 bp位置上，片段大小為633 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測與預期大小一致，在600 bp左右有清晰的特異性條帶，見圖5A。然后經過酶切連接到pTRV2載體上，構建pTRV2-ZDSVIGS載體。對菌落PCR驗證陽性菌液進行質粒提取，并進行雙酶切（KpnⅠ/XhoⅠ）驗證，結果見圖5B。在約600 bp處有單一條帶出現，初步認為構建成功。然后對該質粒進行測序，結果顯示插入片段長度為633 bp，經序列比對與設計片段序列完全吻合，表明pTRV2-ZDS重組載體構建成功。

2.4 農桿菌接種

圖3 煙草與其他植物ZDS基因的系統(tǒng)進化樹

圖4 ZDS基因的時空表達模式分析

圖5 瓊脂糖凝膠電泳圖

八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS）常被作為VIGS體系的指示基因，其沉默后植物新葉出現顯著的白化現象，以驗證TRV載體的侵染效率［12］。分別將轉化有重組質粒的農桿菌（TRV/TRV-PDS/ TRV-ZDS）侵染本氏煙草，TRV-PDS菌液注射煙草約10 d左右，煙草新葉出現顯著的白化現象，表明TRV病毒誘導基因沉默體系已發(fā)揮作用。如圖6所示，TRV-PDS農桿菌侵染一個月后植株表型出現嚴重的光漂白現象。如圖7所示，與陰性對照TRV相比，侵染TRV-ZDS的煙株同時也出現了顯著的光漂白現象，ZDS基因表達被抑制，新生葉片都顯現出嚴重白化現象，株高明顯變矮，長勢不強，但不致死，與PDS基因沉默后表型比較相似。

圖6 PDS基因沉默表型圖

圖7 本氏煙草ZDS基因沉默表型圖

侵染效率考察結果顯示，注射TRV-ZDS農桿菌的20株煙草中，侵染發(fā)病率為100%，表型一致，定量PCR檢測ZDS轉錄表達水平僅有對照植株的10%（甚至更低，P＜0.05）（圖8），而注射TRV煙株與未注射煙株WT之間無顯著性差異（P＞0.05），表明ZDS基因被有效地沉默。由此可見，ZDS基因也可以作為TRV VIGS沉默體系的參照基因，為TRV介導的病毒誘導基因沉默體系提供一個良好的候選參照基因。

圖8 ZDS在本氏煙草TRV 介導的病毒誘導基因沉默體系中基因表達量

2.5 ZDS 基因沉默后對類胡蘿卜素合成通路及代謝物的影響

TRV-ZDS農桿菌侵染煙株后，利用實時熒光定量PCR檢測類胡蘿卜素合成通路相關基因轉錄表達量的變化，結果發(fā)現侵染TRV-ZDS煙株，類胡蘿卜素合成通路基因的表達量均明顯下降（P＜0.05），而注射TRV煙株與未注射WT煙株間無顯著差異（P＞0.05），見圖9。對代謝物類胡蘿卜素及葉綠素含量進行分析發(fā)現，β-胡蘿卜素、紫黃質、新黃質、黃體素及葉綠素a和b也顯著降低（P＜0.05），見圖10。說明煙草中ZDS基因表達受抑制后，嚴重阻礙了植株類胡蘿卜素及葉綠素合成，所以ZDS在類胡蘿卜素合成中起著重要的作用。

圖9 ZDS基因表達抑制后類胡蘿卜素合成通路基因表達量分析

圖10 ZDS基因表達抑制后類胡蘿卜素及色素含量變化

3 結論

從普通煙草紅大中擴增出NtZDS基因序列，發(fā)現該基因至少存在兩個拷貝。該基因在現蕾期、盛花期的葉片和花中表達量較高，推斷該基因生物學功能可能與光合生理過程存在密切關系，對煙草花中類胡蘿卜素的合成可能具有重要的調控作用。

ZDS基因表達下調后，新生葉片出現嚴重白化現象，株高明顯變矮，長勢不強，與PDS基因沉默后表型相似，為TRV介導的病毒誘導基因沉默提供了一個良好的候選參照基因。對沉默植株上下游基因表達量分析及代謝物分析結果都說明ZDS基因在類胡蘿卜素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

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責任編輯 董志堅

Cloning and Functional Analysis ofζ-Carotene Desaturase Gene in Nicotiana tabacum

SHI Yanmei*1,2,WEI Pan*2,CHEN Yuanyuan3,YANG Ran1,JIN Lifeng2,LIU Pingping2,LI Feng2,
QU Lingbo1,4,LIN Fucheng2,and WANG Ran**2
1.College of Chem istry and Molecular Engineering,Zheng zhou University,Zheng zhou 450001,China
2.Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
3.College of Science,Zhong yuan University of Technology,Zheng zhou 451191,China
4.College of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zheng zhou 450001,China

To reveal the function ofζ-carotene desaturase（ZDS）inNicotianatabacum（N.tabacum),NtZDSgene was homologously cloned fromN.tabacumand its phylogenetic analysis was conducted. Fluorescence quantitative PCR techno logy was used to analyze the tem poral and spatial expression patterns ofNtZDSand tobacco rattle virus induced gene silencing（VIGS）system was employed to inhibit the expression ofZDSinNicotianabenthamiana.The expression levels of upstream and downstream genes were further analyzed by fluorescence quantitative PCR,and the changes of pigment contents in tobaccoplants were determ ined.The results showed that there existed at least two homologous copies ofNtZDSgene inN.tabacumwith the sim ilarity of more than 90%in coding sequence toZDSgenes in tomato and potato.The expression level ofNtZDSwas the highest in leaves and flowers at flowering stage.Comparing with the control,the leaves of tobacco p lants presented severe bleaching phenotype afterNtZDSsilencing, it provided a good candidate for reporter gene for VIGS system;meanwhile the expression levels of upstream and downstream genes and pigment contents（carotenoid and chlorophy ll）significantly decreased,it implied thatZDSgene played an important role in the course of growth,development and carotenoid formation ofN.tabacum.

Nicotianatabacum；ζ-carotene desaturase；Gene；Cloning；Expression pattern；Virus induced gene silencing（VIGS)

TS413

A

1002-0861（2015）09-0001-08

10.16135/j.issn1002-0861.20150901

2014-08-25

2015-02-28

中國煙草總公司鄭州煙草研究院科技項目“煙草類胡蘿卜素含量的遺傳調控和材料驗證”（092013CZ0620）。

史艷梅（1985—），在讀博士研究生，研究方向：煙草基因功能研究。E-mail：sym zgh@163.com；*共同第一作者：

魏攀（1983—），博士，工程師，主要從事煙草分子生物學研究。E-mail：weipan83@126.com；**通訊作者：王燃，E-mail：wangranljj2010@163.com

史艷梅，魏攀，陳媛媛，等.煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析［J］.煙草科技，2015，48（9）：1-8.

SHI Yanmei，WEI Pan，CHEN Yuanyuan，etal.Cloning and functional analysis ofζ-carotene desaturase gene in Nicotiana tabacum［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：1-8.