張愛霞

慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染小鼠ESC及其對(duì)干細(xì)胞特性的影響

張愛霞

目的 研究用慢病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)特性的影響。方法 慢病毒載體經(jīng)293FT細(xì)胞包裝后轉(zhuǎn)染小鼠ESC, 熒光顯微鏡下挑選和觀察所得陽性克隆, 檢測ESC特異性標(biāo)志物Oct-4、SSEA-1的表達(dá), 通過擬胚體(EB)誘導(dǎo)體外分化, RT-PCR檢測三胚層的分化。結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察可見所得綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞呈克隆樣鳥巢狀生長, 免疫組化可見GFPESC表達(dá)ESC特異性標(biāo)志Oct-4、SSEA-1, 能形成EB, RT-PCR檢測到甲胎蛋白(AFP)、巢蛋白(Nestin)和血管內(nèi)皮生長因子受體(Flk-1)的表達(dá)。結(jié)論 慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染不影響小鼠ESC的自我更新特性及多向分化潛能。

胚胎干細(xì)胞；慢病毒載體；基因轉(zhuǎn)染；綠色熒光蛋白

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESC)是從附植前早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或早期胎兒原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分離培養(yǎng)而來的多能性細(xì)胞系。ESC因能夠無限增殖并保持未分化狀態(tài)和具有向3個(gè)胚層細(xì)胞分化的潛力, 在研究胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因功能、建立疾病模型等方面有著其他細(xì)胞無法比擬的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)基因研究是更有效利用ESC進(jìn)行各種基因功能研究以及基因治療等的重要手段。研究表明, 自身失活的慢病毒載體(lentivirus vectors, LV)是安全而且有效的轉(zhuǎn)基因載體［1,2］。本文利用慢病毒載體對(duì)小鼠的ESC進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 研究慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)ESC的干細(xì)胞特征的影響, 為以后的ESC轉(zhuǎn)基因研究提供借鑒?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠ESC細(xì)胞系E14.1、293FT細(xì)胞、含ubiquitin C promoter-GFP的慢病毒載體由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心提供。高糖DMEM 培養(yǎng)基、ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix、Lipofectamine 2000和Opti-MEM培養(yǎng)基均購于美國Invitrogen公司； 胎牛血清購于美國Hyclone公司；白血病抑制因子(LIF)購于Chemicon 公司；免疫組化用一抗Oct-4、SSEA-1 抗體均購于美國Millipore公司；二抗購于美國R＆D 公司；明膠購于美國Sigma公司。

1.2 ESC與293FT細(xì)胞的體外培養(yǎng) ESC的培養(yǎng)用含10%胎牛血清、1 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1000 U/ml LIF的高糖DMEM完全培養(yǎng)液, 接種到2%明膠包被的培養(yǎng)皿中, 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。293FT細(xì)胞用含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、500 μg/ml G418的高糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng), 細(xì)胞融合達(dá)80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 慢病毒的包裝 取9 μg的ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix和3 μg的ubiquitin C promoter-GFP載體加入到1 ml的Opti-MEM培養(yǎng)液中混勻。另取36 μl的Lipofectamine 2000加入到1 ml的Opti-MEM培養(yǎng)液中混勻, 室溫放置5 min?；旌虳NA和Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)液, 室溫放置20 min后加入含5×106個(gè)293FT細(xì)胞的無G418的培養(yǎng)液中, 培養(yǎng)24 h后換液。轉(zhuǎn)染72 h后收集含有病毒的培養(yǎng)液, 3000 rpm離心30 min, 0.45 μm濾膜過濾。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染ESC及陽性細(xì)胞克隆的篩選 將培養(yǎng)于6孔板2 d的ESC每孔加入病毒懸液0.5 ml, 培養(yǎng)12 h后換液。72 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況, 選擇陽性克隆, 胰酶消化離心后以10個(gè)/cm2接種密度再次接種到明膠覆蓋的培養(yǎng)皿中, 培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下選擇陽性克隆, 再次消化傳代。連續(xù)選擇2～3次, 便可得到純的表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞克隆, 稱為GFP-ESC。

1.5 GFP-ESC的形態(tài)學(xué)觀察 GFP-ESC接種在2%明膠包被的培養(yǎng)皿中, 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形態(tài)特征及生長狀態(tài)。

1.6 免疫組化檢測表面分子標(biāo)志物 將種植于6孔板上的GFP-ESC用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定20 min, 用二抗宿主血清封閉30 min。加入一抗抗體Oct-4(1：200 稀釋)、SSEA-1(1：100稀釋)并于4℃孵育過夜。PBS 洗滌, 以Cy3標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h, PBS洗滌, 熒光顯微鏡下觀察。

1.7 GFP-ESC體外分化檢測 將GFP-ESC接種在低粘附性的培養(yǎng)皿中, 以不含LIF的ESC培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng), 將形成的擬胚體(embryoid body, EB)在熒光顯微鏡下觀察, 懸浮培養(yǎng)10 d后, 提取總RNA作RT-PCR檢測以鑒定胚體中三個(gè)胚層來源細(xì)胞的存在。

1.8 RT-PCR檢測 按照試劑盒要求從EB中抽提RNA, 檢測Nestin、Flk-1和AFP。PCR 條件：94℃ 4 min, 30個(gè)周期(94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 68℃ 1 min), 72℃ 10 min。引物序列(5′-3′)：巢蛋白：正向 CTCTCCCTGACTCTACTCCCT, 反向CATCTTCTTCC TCTCCCTCTT；Flk-1：正向TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG,反向TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG；甲胎蛋白：正向 GCT CACACCAAAGCGTCAAC, 反向CCTGTGAACTCTGGTATCAG。

2 結(jié)果

2.1 GFP-ESC的生長狀態(tài) GFP-ESC具有典型的克隆形態(tài),呈鳥巢狀, 邊緣清楚, 表面平滑,結(jié)構(gòu)致密, 細(xì)胞小而圓, 細(xì)胞之間界線不清楚。見圖1。

圖1 GFP-ESC細(xì)胞克隆(×100)

2.2 胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志免疫組化檢測 熒光顯微鏡下觀察GFP-ESC免疫熒光染色結(jié)果, 可見呈紅色熒光的Oct-4、SSEA-1 的表達(dá)。見圖2。

圖2 小鼠GFP-ESC的特異性標(biāo)志物的免疫熒光分析(×400)

2.3 GFP-ESC的體外分化能力 用不含LIF 的ESC培養(yǎng)液體外懸浮培養(yǎng)后, GFP-ESC能形成簡單擬胚體或是囊狀擬胚體, 熒光顯微鏡下觀察可見GFP的表達(dá)。將擬胚體抽提RNA, RT-PCR檢測到AFP、Nestin和Flk-1的表達(dá)。見圖3。

圖3 小鼠GFP-ESC的體外分化(×100)

3 討論

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體有病毒載體和非病毒載體兩類。非病毒載體的轉(zhuǎn)染中較多應(yīng)用脂質(zhì)體或電穿孔法, 但脂質(zhì)體和電穿孔對(duì)細(xì)胞毒性較大, 特別是對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低［3,4］。病毒載體目前有腺病毒載體、慢病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體。腺病毒屬于雙鏈DNA病毒, 其轉(zhuǎn)染后病毒基因游離于宿主細(xì)胞基因組外, 瞬時(shí)表達(dá)外源基因。反轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA病毒,其轉(zhuǎn)染后病毒基因能夠整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi), 能夠穩(wěn)定、長時(shí)間表達(dá)外源基因, 但是反轉(zhuǎn)錄病毒只轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞, 不轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞, 且對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高［5,6］。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種, 為非致癌性病毒, 可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞, 借助慢病毒可將其攜帶的外源基因高效整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中, 從而使基因穩(wěn)定持久地表達(dá), 成為當(dāng)前轉(zhuǎn)基因載體研究的熱點(diǎn)［7,8］。

研究表明, 慢病毒與其他病毒載體相比較有著高效的轉(zhuǎn)染率, 尤其對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 如原代細(xì)胞、干細(xì)胞, 其轉(zhuǎn)染效率達(dá)75%以上［9,10］。在本研究中, 慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察, 也可見到明顯的轉(zhuǎn)染的陽性克隆, 說明慢病毒對(duì)于ESC是一種高效的轉(zhuǎn)染載體。慢病毒轉(zhuǎn)染后的GFP-ESC仍然維持其自我更新特性, 胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志分子表達(dá)陽性, 仍然具有向三胚層分化的潛能, 表明慢病毒載體是ESC轉(zhuǎn)基因研究中的理想轉(zhuǎn)染介質(zhì)。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶GFP的慢病毒可高效感染小鼠ESC, 其對(duì)細(xì)胞的自我更新以及多向分化潛能均無影響,從而為后續(xù)進(jìn)行攜帶外源基因的功能研究以及建立疾病模型等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Lentiviral mediated GFP in transfection of mice ESC and its influence on stem cell features

ZHANG Ai-xia.
School of Bioscience, Jiaying College, Meizhou 514015, China

Objective To study the influence of gene transfection by lentiviral vector on mice embryonic stem cell (ESC) features.Methods Transfection of mice ESC was made by lentiviral vector after 293FT cell packing.Positive clone was chosen and observed under fluorescence microscope.Expressions of Oct-4 and SSEA-1 as ESC specific markers were detected.In vitro differentiation was induced by embryoid body (EB), and RT-PCR was applied to detect differentiation of triploblastica.Results Green fluorescent protein (GFP) positive cell showed colon bird-nest growth by morphological observation.Immunohistochemistry showed Oct-4 and SSEA-1 as ESC specific markers could form EB.Expressions of alpha fetoprotein (AFP), nestin and vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1) could be detected by RT-PCR.Conclusion Gene transfection mediated by lentiviral vector has no influence on self-renewal feature and multi-directional differentiation potency of mice ESC.

Embryonic stem cell; Lentiviral vector; Gene transfection; Green fluorescent protein

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.11.002

2014-11-20］

514015 嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心