郭旭東，李相冬，呂曉亮，趙 平，姜彥陽，孟繁波＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院）

基因芯片分析急性心肌梗死患者外周血差異基因表達譜

郭旭東1，李相冬1，呂曉亮2，趙 平3，姜彥陽4，孟繁波1＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院）

冠狀動脈疾病、心肌梗死是由多種遺傳和環(huán)境因素，以及它們之間的相互作用引起的［1］。2007年的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWA）揭示了遺傳與急性心肌梗死的關(guān)系。目前已經(jīng)有11個染色體片段（chromosome segments）確定與心肌梗死相關(guān)。有研究表明染色體9p21與冠心病相關(guān)性最強［2，3］。這些異常基因?qū)砜赡茏鳛榧毙孕募」Ｋ涝\斷及治療的新靶點。當(dāng)前的熱點基因PSCK9被證實與脂代謝相關(guān)，人們發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)PCSK9可以影響低密度脂蛋白膽固醇的水平。而抑制PCSK9的表達作為一種有效的降脂治療新方法，已證明可以降低血脂并提高他汀類藥物的療效［4］。本研究擬采用基因芯片方法尋找與急性心肌梗死相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死診斷的基因標(biāo)記，并探索能用于急性心肌梗死治療的靶基因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012.06－2014.08在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院住院治療的12例急性心肌梗死患者為研究對象，其中男9例，女3例。另外選擇12例健康人設(shè)為對照組。3例急性心肌梗死組患者與3例健康對照組患者外周血RNA進行基因芯片檢測。9例急性心肌梗死組與9例健康對照組進行熒光定量PCR驗證。兩組臨床資料進行比較，相關(guān)結(jié)果顯示，各組間性別、年齡、腎功能、血脂、血糖、高血壓、家族史、吸煙及飲酒史、他汀類藥物服用史均無顯著性差異（P＞0.05）。

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) 急性心肌梗死診斷以中華醫(yī)學(xué)會心血管分會2010年修訂的急性心肌梗死診斷和治療指南為標(biāo)準(zhǔn)。心臟生物標(biāo)志物增高或增高后降低，至少有1次數(shù)值超過參考值上限的第99百分位數(shù)（即正常上限），并有以下至少1項心肌缺血的證據(jù)：①心肌缺血臨床癥狀；②心電圖出現(xiàn)新的心肌缺血變化，即新的ST段改變或左束支傳導(dǎo)阻滯［按心電圖是否有ST段抬高，分為急性ST段抬高型心肌梗死STEMI和非STEMI］，③心電圖出現(xiàn)病理性Q波；④影像學(xué)證據(jù)顯示新的心肌活力喪失或區(qū)域性室壁運動異常。健康對照組為既往無心肌缺血病史，心電圖、心臟彩超、心肌酶、平板運動實驗正常者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 兩組入選者均排除糖尿病、肝功能不全、腎功能不全、外周動脈疾病、腫瘤、腦卒中。

1.2 研究方法

1.2.1 基因芯片檢測 抽取急性心肌梗死組3例，健康對照組3例共6例外周血樣本2ml，加入2ml－Trizol，－80℃保存，送北京鼎國昌盛有限公司進行基因芯片檢測。本試驗所用芯片為美國Affymetrix公司研制的人全基因組芯片，芯片表達譜構(gòu)建由北京鼎國昌盛生物有限公司完成。

1.2.2 外周血RNA提取 白細胞分離抽取研究對象晨起空腹靜脈血2ml，加入EDTA抗凝管中，進行白細胞分離。①取2ml抗凝外周血（采血時間不超過3h）②加入等體積無菌PBS于外周血中充分混合，形成細胞懸液；③加入4ml淋巴細胞分離液于另一離心管。④吸取4ml細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面（注意勿與淋巴細胞分離液混合）。離心1 500rpm 20min。⑤用吸管輕輕吸出界面層（白膜）入另一離心管中。無菌冷PBS洗2次，最后1次洗滌可以將細胞懸液移入EP管中，離心去上清，用于提取RNA。RNA提取先加1ml Trizol于EP管中，若凍存細胞直接加入Trizol，不需解凍，吹打裂解后室溫靜置5－10min。⑥加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），劇烈震蕩15s，室溫靜置2－3min。在4℃下1，2000轉(zhuǎn)離心15min。⑦小心吸出上清水相約600μl移入另一離心管（注意不要抽到蛋白層），加入500μl異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。⑧4℃1，2000g離心10min，棄上清液，底部可見白色物質(zhì)。⑨加入1ml 75%冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇。⑩4℃7 500g離心5 min，去除乙醇后晾5－10min，半透明即可，以20 μlDEPC水溶解RNA。取3μlRNA樣本，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（見圖1）；1μlRNA樣品于紫外分光光度計檢測濃度，以A260／280在1.8－2.0視為RNA樣本合格。不合格樣本棄去。

1.2.3 cDNA的合成 使用TOYOBO ReverTra Ace試劑盒。將RNA在65℃條件下加熱5min，立即放于冰上冷卻。配制反應(yīng)液，反應(yīng)液組成Nuclease－free Water up to 10μl，5×RT Buffer 2μl，RT Enzyme Mix 0.5μl，Primer Mix 0.5μl，RNA 0.5pg－1μg，Total volume 10μl。在37℃條件下，進行15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在98℃條件下，進行5 min的酶失活反應(yīng)。保存在－20℃冰箱中。以備進行熒光定量PCR檢測。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 熒光定量采用TIANGEN熒光定量預(yù)混試劑增強版。建立20μl體系，加入2×SuperReal PreMix Plus10μl，正向引物0.6μl，反向引物0.6μl，cDNA模板2μl，50× ROX Reference Dye△0.4μl，RNase－free ddH2O 6.4μl。使用Mx3005P設(shè)備進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：1×95℃15min，40×（95℃10sec＋62℃30sec）。隨機選取上調(diào)基因CYP4F3、下調(diào)基因USP25、表達無差異基因IL13RA1進行熒光定量驗證。應(yīng)用GAPDH為內(nèi)參，采用2－△△Ct法進行差異倍數(shù)計算。每組取3個樣本，每個樣本進行3次重復(fù)，進行熒光定量PCR檢測。PCR引物序列如下表1。

圖1 部分RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行統(tǒng)計描述，組間差異采用t檢驗；定性資料采用頻數(shù)及率進行統(tǒng)計描述，組間差異采用卡方檢驗或Fisher檢驗；若P＜0.05，則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 熒光定量引物序列

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果分析 基因芯片結(jié)果按照p－value≤0.05，logFC絕對值＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，心肌梗死組與對照組檢出559個RNA片段存在差異。其中低表達基因271個，高表達基因288個（圖略）。本研究采用SAM分析軟件用于基因表達數(shù)據(jù)分析。

2.2 差異基因生物信息分析 比較基因芯片結(jié)果共篩選出559個差異基因，對這些差異基因進行GO分析，這些基因歸屬于128個細胞組成，參與了521個生物過程和151個分子功能。

2.3 差異基因代謝通路分析 對差異基因進行KEGG分析559個基因共參與107個基因通路。

2.4 熒光定量PCR結(jié)果分析 本研究中目標(biāo)基因與內(nèi)參基因溶解曲線為單一峰型，未見其它峰型，峰型較尖銳（見圖2），提示各基因溶解溫度均一，擴增產(chǎn)物特異性好，未見非特異性雙鏈DNA產(chǎn)物及二聚體。擴增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S型曲線形狀完好，符合定量要求（見圖3）。

圖4 CYP4F3、USP25、IL13RA1基因熒光定量相對表達差異

熒光定量PCR結(jié)果：急性心肌梗死組外周血基因CYP4F3表達高于對照組P＝0.006；急性心肌梗死組外周血基因USP25表達低于對照組P＝0.003；急性心肌梗死組IL13RA1表達與對照組無差異P＝0.681（見表2），與基因芯片結(jié)果表達趨勢一致（見圖4）。說明基因芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 熒光定量PCR基因表達差異分析

3 討論

在過去十幾年中，已確定急性心肌梗死發(fā)病與數(shù)個基因變異相關(guān)，這些基因變異涉及凝血蛋白，纖溶系統(tǒng)，血小板受體，高半胱氨酸代謝，血管內(nèi)皮功能障礙，異常血流和氧化應(yīng)激等［5］。而近幾年的研究表明，伴有冠狀動脈鈣化、擴張和主干狹窄的冠心病比其他情況更多地受到遺傳因素的影響［3］。有報道外周血相關(guān)的基因的多態(tài)性檢測能夠比較準(zhǔn)確的預(yù)測疾病的發(fā)生幾率［6］。本研究通過分析急性心肌梗死病人外周血基因RNA的差異表達，發(fā)現(xiàn)了急性心肌梗死病人中有559個表達差異基因，其中288個基因高表達，271個基因低表達。

對這些差異基因進行KEGG通路分析，559個差異基因共參與了107條基因通路，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease）、上皮細胞信號在幽門螺桿菌感染（Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection）、受體相互作用（Cytokine－cytokine receptor interaction）、細胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）、腎細胞癌（Renal cell carcinoma）等。

本研究中差異基因較為集中分布的通路，已有多條與冠心病、急性心肌梗死相關(guān)，其中14個差異基因參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus）途徑，4個基因參與阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease）代謝途徑，目前已有報道證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者心血管疾病的風(fēng)險性增加［7］，有文獻證明阿爾茨海默病可能有冠心病存在關(guān)聯(lián)［8］。其他通路如細胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）也有與心肌梗死相關(guān)的報道。

本研究差異基因中有3個基因參與了卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolismz）代謝途徑，而目前的研究尚未見關(guān)于卟啉和葉綠素代謝與急性心肌梗死有關(guān)的報道，該途徑與急性心肌梗死具體有何關(guān)聯(lián)尚未明確。

本研究中CYP4F3是P450大家族中的成員，屬CYP4F亞家族，P450酶系是自然界中廣譜的生物催化劑，能夠作用于多種物質(zhì)。Granville等人發(fā)現(xiàn)再灌注階段注射CYP非特異性抑制劑氯霉素、西咪替丁及CYP2C9選擇性抑制劑磺胺苯吡唑能明顯減少大鼠心臟ROS的生成，縮小心梗面積。該實驗首次提出心臟CYP參與心肌損傷，機制可能與經(jīng)CYP途徑促活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS）生成有關(guān)。同時，再灌注階段給藥對心肌的保護作用表明急性心肌缺血患者于缺血后采取藥物治療仍可能有效，該發(fā)現(xiàn)具有重要臨床意義［9］。

ROS是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)，是細胞凋亡的介導(dǎo)信號分子。CYP4F3的代謝產(chǎn)物20－HETE是小動脈的強收縮劑，能通過抑制Kca通道，激活L型Ca2＋通道，以及活化PKC等途徑，增加細胞內(nèi)鈣含量，收縮微小動脈。損傷作用可能與阻斷心臟sarcKatp通道有關(guān)。本研究中CYP4F3在心肌梗死組表達升高，表明CYP4F3可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷與修復(fù)過程。

USP25是USPS家族成員之一，范素蛋白酶體積系與腫瘤發(fā)生的所有進程，其家族成員USP22、USP28均證明與腫瘤相關(guān)［10，11］。而USP25已證明參與了非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，通過誘導(dǎo)miR－200C促進部分非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移［12］。還有研究證明USP25能夠負調(diào)控IL17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［13］。在本研究中USP25與健康組比較表達量降低，而急性心肌梗死與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，但USP25如何參與急性心肌梗死的發(fā)病機制仍不清楚。

急性心肌梗死組與健康對照組比較共篩選出差異基因559個，其中288個基因高表達，271個基因低表達。GO分析顯示：這些基因歸屬于128個細胞組成，參與了521個生物過程和151個分子功能；KEGG分析共參與107個基因通路。對差異基因進行基因水平驗證，進一步證實了基因芯片分析結(jié)果可信。

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2014－10－19）

1007－4287（2015）06－0977－04

＊通訊作者