鄭 妍，劉忠民，李 靜，王永良

（吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

不同負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax的影響

鄭 妍，劉忠民＊，李 靜，王永良

（吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

隨著人們年齡的逐漸增大，大腦會(huì)在組織形態(tài)學(xué)方面有所改變，更重要的是在其神經(jīng)生化等方面也會(huì)隨著人年齡的增長(zhǎng)而出現(xiàn)一系列的改變，這些改變會(huì)使其逐步走向衰老，這是自然界一種復(fù)雜的生命現(xiàn)象。在老齡化社會(huì)背景下，以認(rèn)知機(jī)能退行為主要特征的腦老化問題十分突出，其進(jìn)行性風(fēng)險(xiǎn)是老年性癡呆。海馬神經(jīng)是執(zhí)行認(rèn)知機(jī)能的靶器官，是人體認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力的控制中樞。人體衰老后，大腦也會(huì)逐漸老化，而此時(shí)腦海馬區(qū)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。運(yùn)動(dòng)干預(yù)延緩海馬神經(jīng)的認(rèn)知老化是目前防治認(rèn)知退行性疾病的主流研究之一。

多數(shù)研究認(rèn)為，通過運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)海馬神經(jīng)突觸數(shù)量減少［1］和突觸體膜流動(dòng)性下降［2］，增加c－fos等基因的表達(dá)［3］，延緩腦老化的進(jìn)程。然而運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)海馬神經(jīng)認(rèn)知老化的具體效果與機(jī)制研究尚屬少見，仍然有待于進(jìn)一步研究，究竟何種機(jī)制占主導(dǎo)也尚待實(shí)驗(yàn)證明。因此，還需進(jìn)一步提出假說及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，尋求改善認(rèn)知機(jī)能的相關(guān)的有力依據(jù)和不利影響，從而明晰其機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)干預(yù)腦老化的深入研究奠定基礎(chǔ)，提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

16月齡的雄性wistar大鼠48只，生產(chǎn)許可證為SCXK（吉）－2013－0001，全部由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)平均分為對(duì)照組（無人為的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，常規(guī)飼養(yǎng)）、大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（每天游泳60min）、中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（每天游泳30 min）、小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（每天游泳15min）［35］。進(jìn)行為期八周的游泳運(yùn)動(dòng)，在水溫30±1℃，在直徑為60cm，高80cm，水深70cm的圓形桶中進(jìn)行。

1.2 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)

行為學(xué)測(cè)試采用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，為期八周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行禁食減重，減至體重的85%，讓大鼠產(chǎn)生饑餓感，這樣在行為學(xué)測(cè)試時(shí)，大鼠才有想要覓食的動(dòng)力。體重達(dá)標(biāo)后，進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，為期3天，每天1次。適應(yīng)性訓(xùn)練開始時(shí)在每個(gè)臂的盡頭處放置少量飼料，將老齡大鼠放置于八臂迷宮中央處，讓其自由選擇并吃食，每只大鼠適應(yīng)5min后取出。

正式實(shí)驗(yàn)共為期7天，隨機(jī)選擇4個(gè)臂放置食物；每只大鼠將4個(gè)臂食物吃盡后取出，即結(jié)束1次測(cè)試；如5min后臂中食物仍未吃完，則也將大鼠取出，即結(jié)束1次測(cè)試；測(cè)試期間進(jìn)行全程實(shí)時(shí)監(jiān)控。測(cè)試指標(biāo)為：①完成時(shí)間：老齡大鼠吃完所有食物所用時(shí)間，如果到5min后食物仍有剩余，則停止測(cè)試，按照5min記錄時(shí)間；②工作記憶錯(cuò)誤：老齡大鼠每重復(fù)進(jìn)入已吃過食物的臂1次則為1次工作記憶錯(cuò)誤，記錄每次測(cè)試時(shí)大鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)。

每次測(cè)試時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件保持一致；每只大鼠測(cè)試完畢后，用酒精認(rèn)真擦洗實(shí)驗(yàn)器材，避免留下殘留氣味。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材及免疫組化染色測(cè)試

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，對(duì)老齡大鼠進(jìn)行解剖以備進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。在運(yùn)動(dòng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，由于高齡、溺水等原因各組大鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在行為學(xué)測(cè)試后，每組大鼠剩余數(shù)為：大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組6只，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組7只，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組8只，對(duì)照組10只，因此每組隨機(jī)抽取出6只老齡大鼠進(jìn)行解剖以備進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

首先給大鼠注射鹽酸利多卡因注射液（5ml／只）將大鼠麻醉，隨后將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上；利用手術(shù)工具打開大鼠腹腔，并暴露大鼠的心臟，然后從大鼠心臟左心室尖處依次灌注0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛固定液。固定后，將大鼠斷頭并取其海馬組織浸泡在10%中性福爾馬林固定液中，石蠟包埋切片，進(jìn)行免疫組化染色時(shí)嚴(yán)格按照說明書要求由專業(yè)技術(shù)人員操作。

1.4 圖像分析與數(shù)據(jù)處理方法

八臂迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用組間對(duì)比使用重復(fù)測(cè)量方差分析的方法，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

免疫組化圖像分析采用正置顯微鏡，計(jì)數(shù)同一視野下陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Student’s t－test方法，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 對(duì)各組老齡大鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)后進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)和海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 各組老齡大鼠進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，老齡大鼠每次進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（見表1）。完成時(shí)間，與對(duì)照組相比，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組用時(shí)最少（P＜0.05）；大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組多于對(duì)照組（P＞0.05）；工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)，與對(duì)照組相比，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組明顯減少（P＜0.05）；大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組出現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)最多（P＜0.05）；中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組低與大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）。

2.2 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax表達(dá)

不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組的各只老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)占其同一視野下總細(xì)胞數(shù)的比值情況（見表1），免疫組化表達(dá)圖（見圖1）。Bcl－2的免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，呈棕褐色顆粒。與對(duì)照組相比，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組Bcl－2的表達(dá)最多（P＜0.01）；中等負(fù)荷組處于大負(fù)荷組與小負(fù)荷組之間，雖略高于對(duì)照組，但是二者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組低于對(duì)照組（P＜0.01）。

不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組的各只老齡大鼠海馬神經(jīng)Bax的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)占其同一視野下總細(xì)胞數(shù)的比值情況（見表1），免疫組化表達(dá)圖（見圖2）。Bax的免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，呈棕褐色顆粒。與對(duì)照組相比，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組海馬神經(jīng)Bax的表達(dá)最少（P＜0.05）；中等負(fù)荷組處于大負(fù)荷組與小負(fù)荷組之間，雖略高于對(duì)照組，但是二者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組表達(dá)顯著增多（P＜0.01）。

圖1 海馬神經(jīng)Bcl－2表達(dá)情況

圖2 海馬神經(jīng)Bax表達(dá)情況

3 討論

在為期8周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后，老齡大鼠進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄各組老齡大鼠每次完成八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，來表示其學(xué)習(xí)記憶的效果，從而體現(xiàn)其學(xué)習(xí)記憶能力的差異。完成時(shí)間越短，說明其學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)、學(xué)習(xí)速度越快；如完成時(shí)間越長(zhǎng)，則說明其學(xué)習(xí)記憶能力下降。記錄各組老齡大鼠進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)，來表示其學(xué)習(xí)記憶的效果，從而體現(xiàn)其學(xué)習(xí)記憶能力的差異。工作記憶錯(cuò)誤出現(xiàn)的次數(shù)越少，說明其學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)、學(xué)習(xí)速度越快；如工作記憶錯(cuò)次數(shù)越多，則說明其學(xué)習(xí)記憶能力下降。本研究結(jié)果顯示：小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組完成時(shí)間最短，工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)最少，說明長(zhǎng)期堅(jiān)持適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)鍛煉有助于提高學(xué)習(xí)記憶能力。

進(jìn)行適宜負(fù)荷的體育鍛煉對(duì)提高學(xué)習(xí)記憶能力是有促進(jìn)作用的，其發(fā)生機(jī)制為：經(jīng)常性的進(jìn)行運(yùn)動(dòng)可以改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能，使大鼠腦內(nèi)紋狀體、海馬、前額葉皮層及伏隔核的DA代謝加強(qiáng)，使記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生變化，對(duì)發(fā)展智力起到促進(jìn)的作用；與此同時(shí)，還可以通過逆轉(zhuǎn)突觸數(shù)量減少和突觸體膜流動(dòng)性下降，提高大腦的工作效率，從而對(duì)延緩腦衰老起到重要作用。此外，堅(jiān)持進(jìn)行適宜的有氧運(yùn)動(dòng)，有助于加快人體的血液循環(huán)能力、并加快其氣體交換的能力，可以使全身的微細(xì)血管開放，這樣更充足的氧氣就可以供給給大腦，可以有效地改善大腦皮層神經(jīng)活動(dòng)過程的興奮性以及各中樞之間的協(xié)調(diào)性，這也將對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的提高起到促進(jìn)作用［6］。

Bcl－2作為一種抗凋亡蛋白，對(duì)MPT（即線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔，mitochondria permenbility transition pore）的開放具有一定的調(diào)節(jié)作用，其存在形式為細(xì)胞器（如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜）的整合膜蛋白；而Bax作為一種促凋亡蛋白，分布于細(xì)胞骨架上或者是胞漿中，形式為非活性。當(dāng)死亡的信號(hào)刺激細(xì)胞后，促凋亡蛋白Bax就會(huì)出現(xiàn)構(gòu)象的改變，由胞漿中轉(zhuǎn)至線粒體外膜，并與膜上的抗凋亡蛋白發(fā)生相互作用，使抗凋亡蛋白喪失對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，引起線粒體內(nèi)各種促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。

人們?cè)趯?duì)人類和動(dòng)物的認(rèn)知功能進(jìn)行研究時(shí)，通常將海馬視為經(jīng)典區(qū)域并作為重點(diǎn)對(duì)象開展相關(guān)研究。目前已有部分研究指出，大鼠的海馬神經(jīng)元的凋亡是造成其認(rèn)知功能受到損害的主要原因［8，9］。本研究中，在進(jìn)行8周的不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2和Bax的表達(dá)存在差異，多重比較后發(fā)現(xiàn)，小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組和中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組Bcl－2的表達(dá)升高并伴隨Bax的表達(dá)降低，且小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生甚微，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組情況則相反。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以激發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［10］，其凋亡程度主要取決于運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量的多少，通過Bcl－2和Bax表達(dá)的多少可以反映出細(xì)胞凋亡的情況。進(jìn)行8周的運(yùn)動(dòng)后，不同的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷會(huì)給老齡大鼠帶來不同的刺激致使其海馬神經(jīng)Bcl－2和Bax會(huì)出現(xiàn)不同的表達(dá)。其中小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組的大鼠其海馬神經(jīng)Bcl－2表達(dá)最多，Bax表達(dá)最少，而大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組的結(jié)果正好與之相反，說明老齡大鼠進(jìn)行小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以有效抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而長(zhǎng)期的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)則會(huì)使其凋亡現(xiàn)象顯著增加。

通過研究發(fā)現(xiàn)，適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可以對(duì)機(jī)體產(chǎn)生良性的影響。在一定的生理范圍內(nèi)，運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)的作用。

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2014－10－17）

1007－4287（2015）06－0890－04

吉林省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)201215037），吉林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)2014074）

＊通訊作者