韋江彭海燕蘇翠云宋向群王惠臨寧瑞玲周韶璋

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院化療二科；2廣西醫(yī)科大學研究生學院

基礎研究

EM L4-ALK融合基因陽性表達的人肺腺癌H 2228細胞對克唑替尼耐藥后BIM信號通路的影響

韋江1，2彭海燕1，2蘇翠云1宋向群1王惠臨1寧瑞玲1周韶璋1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院化療二科；2廣西醫(yī)科大學研究生學院

目的 建立人肺腺癌H2228克唑替尼耐藥細胞株，探討克唑替尼（crizotinib）誘導EML4-ALK融合基因陽性表達的人肺腺癌細胞H2228在BIM信號通路中的作用。方法 克唑替尼按50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L的濃度逐步遞增法誘導人肺腺癌H2228細胞株獲得性耐藥；分別采用MTT法和流式細胞術檢測H2228和H2228/CR細胞在不同濃度克唑替尼作用后的IC50和細胞凋亡率；采用Western blot法檢測H2228和H2228/CR細胞在BIM信號通路關鍵分子ALK、p-ALK、ERK、p-ERK及BIM蛋白表達的變化。結果 成功誘導克唑替尼耐藥細胞株H2228/CR；MTT法檢測H2228/CR細胞和H2228細胞的IC50分別為3 418 nmol/L、335 nmol/L，H2228/CR細胞的耐藥指數為10.20，H2228/CR細胞在不同濃度克唑替尼作用下的增殖抑制率低于H2228細胞（P＜0.05）；流式細胞術檢測顯示克唑替尼對H2228細胞有促凋亡作用，且呈時間依賴性（P＜0.05），H2228/CR細胞的凋亡率明顯低于H2228細胞的凋亡率（P＜0.05）；Western blot法檢測顯示H2228/CR細胞的p-ALK、p-ERK的表達不受抑制，BIM蛋白表達無上調趨勢。結論 實驗表明H2228/CR耐藥細胞中的BIM蛋白的表達與其耐藥有關。初步闡明EML4-ALK陽性表達的非小細胞肺癌克唑替尼耐藥產生的可能機制，BIM在誘導EML4-ALK陽性表達的人肺腺癌細胞株H2228對克唑替尼產生耐藥發(fā)揮重要作用，提示BIM可作為克服克唑替尼耐藥的一個靶點。

肺腫瘤；EML4-ALK融合基因；H2228細胞；克唑替尼；獲得性耐藥；BIM

肺癌已成為致死率最高的癌癥之一。目前晚期非小細胞肺癌的治療方式主要是傳統(tǒng)化療，但其療效并不理想。近年來，分子靶向治療已成為肺癌研究的熱點，克唑替尼是針對ALK/c-Met雙靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑，與位于細胞膜內側的酪氨酸激酶ATP結合域競爭性相結合，通過阻斷該通路的信號傳導來實現細胞的生長抑制和促進凋亡［1］，其在治療含EML4-ALK的非小細胞肺癌已取得顯著療效［2］，然而在一段時間治療后不可避免地出現耐藥［3］。BIM作為促凋亡家族成員之一，現已證實在腫瘤細胞耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。本研究通過建立含有ALK融合基因的耐藥細胞株H2228/CR，觀察ALK下游BIM基因的變化，以探討H2228細胞在克唑替尼耐藥前后BIM信號通路的變化。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人非小細胞肺腺癌細胞H2228購于美國ATCC公司。

1.2 主要試劑與儀器

克唑替尼粉末制劑購于美國Selleckchem公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清、胰蛋白酶替代物購自美國Gibco公司，MTT購自美國Amresco公司，Western blot儀器設備購于美國Bio-Rad公司，ALKⅠ抗、p-ALKⅠ抗，ERKⅠ抗、p-ERKⅠ抗/BIMⅠ抗以及熒光Ⅱ抗均購自美國Cell Signaling公司，BCA試劑盒購自美國Merck公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及建立耐藥細胞株 H2228耐藥細胞株的誘導采用克唑替尼濃度遞增的方法。購于ATCC公司的人非小細胞肺腺癌細胞株H2228利用二甲基亞砜（DMSO）冷凍保存，細胞復蘇采用快速融化法，迅速放入38℃水浴中，1min內使其完全融化，離心棄去上清液，細胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基中。H2228細胞在含有50 nm/L克唑替尼的培養(yǎng)基中孵育，每72 h換一次培養(yǎng)液；細胞長至80%培養(yǎng)瓶后傳代，繼續(xù)孵育在含有50 nm/L克唑替尼的培養(yǎng)基，待細胞穩(wěn)定生長后將克唑替尼濃度增加至100 nm/L繼續(xù)培養(yǎng)，細胞穩(wěn)定生長后增加克唑替尼濃度至200 nm/L繼續(xù)培養(yǎng)，依次不斷增加克唑替尼的濃度，直到H2228細胞在1 000 nmol/L克唑替尼濃度下穩(wěn)定生長傳代，誘導時間為8個月，誘導耐藥細胞株命名為H2228/CR。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 將處于對數生長期的H2228和H2228/CR細胞按（6～10）×103個/孔的細胞密度接種到96孔板，設6個濃度，每個濃度設4個復孔，待細胞生長貼壁后，按濃度梯度法加入含不同濃度的克唑替尼培養(yǎng)液，把細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h后，吸去孔內液體，每孔加入MTT液繼續(xù)孵育4 h后再加入DMSO，充分振蕩10min，在492 nm波長下測量吸光度值，計算出克唑替尼對H2228/CR及H2228細胞的IC50，耐藥指數（resistance index，RI）=H2228/CR細胞IC50/H2228細胞IC50。實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的對數生長期H2228細胞與H2228/CR細胞，以4×105個/孔、5×105個/孔、7×105個/孔的細胞分別接種于6孔板中（其中H2228、H2228/CR各接種8個孔），培養(yǎng)24 h，H2228和H2228/CR細胞加入克唑替尼濃度為300 nmol/L血清培養(yǎng)液，分別將4×105個/孔接種的細胞培養(yǎng)72 h，5×105個/孔接種的細胞培養(yǎng)48 h，7×105個/孔接種的細胞培養(yǎng)24 h，以細胞凋亡試劑盒說明書的操作收集細胞并染色，用流式細胞術檢測儀測定細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3.4 Western blot法檢測克唑替尼對H2228細胞耐藥前后ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白表達的影響 收集長滿培養(yǎng)瓶的H2228細胞和H2228/CR細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所得總蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，ALKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，p-ALKⅠ抗稀釋度為1∶1 500，BIMⅠ抗稀釋度為1∶1 000，兔ERKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，p-ERKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，鼠Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000，兔Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000。以肌動蛋白（β-actin）作為內參照。紅外熒光Ⅱ抗（DyLight 680 conjugate）顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理和分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組數據的比較采用t檢驗，多組數據的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測克唑替尼對 H2228細胞和H2228/CR細胞增殖抑制的影響

采用克唑替尼濃度遞增方法，經過8個月誘導，成功建立克唑替尼耐藥細胞株H2228/CR。MTT法檢測結果顯示克唑替尼對H2228細胞和H2228/CR細胞的IC50分別為335 nmol/L和3 418 nmol/L，H2228/CR細胞的耐藥指數為10.20。H2228/CR細胞在不同濃度克唑替尼作用下的細胞增殖抑制率低于H2228細胞（P<0.05）。見表1。

表1 不同濃度的克唑替尼處理H 2228細胞和H 2228/CR細胞72 h后細胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 不同濃度的克唑替尼處理H 2228細胞和H 2228/CR細胞72 h后細胞增殖抑制率的比較（±s）

克唑替尼濃度（nmol/L）細胞株30 90 270 810 H2228/CR 4.15±0.20 6.93±1.41 13.26±1.05 22.39±1.65 H2228 10.62±0.56 22.11±1.06 29.30±1.21 80.40±1.24 t -16.525 54.203 14.435 38.260 P 0.004 <0.001 0.005 0.001

2.2 流式細胞術檢測克唑替尼對 H2228細胞和H2228/CR細胞凋亡的影響

根據MTT法檢測H2228細胞生長的情況，選用300 nmol/L克唑替尼以不同培養(yǎng)時間（24 h、48 h、72 h）處理 H2228細胞和 H2228/CR細胞，檢測其細胞凋亡率。結果H2228細胞凋亡率分別為（19.17±0.63）%、（28.18±1.49）%、（43.54±3.18）%；H2228/CR細胞凋亡率分別為（3.33±0.17）%、（6.31±1.62）%、（9.50±1.32）%。結果顯示克唑替尼對H2228細胞有促凋亡作用，且具有時間依賴性（P<0.05）；H2228/CR細胞的凋亡率明顯低于H2228細胞（P＜0.05）。說明H2228/CR細胞對克唑替尼產生耐藥。見圖1、圖2。

圖1 克唑替尼（300 nmol/L）對H 2228細胞和H 2228/CR細胞不同時間點的細胞凋亡流式圖

圖2 克唑替尼（300 nmol/L）對H2228細胞和H2228/CR細胞不同時間點的細胞凋亡率的影響

2.3 Western blot法檢測ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白的表達水平

結果顯示，在H2228/CR細胞中隨著克唑替尼濃度增加，p-ALK、p-ERK蛋白的表達不受抑制，BIM蛋白的表達無上調趨勢。而在H2228細胞中，p-ALK、p-ERK蛋白的表達呈下降趨勢，BIM的三個異構體Bim-s、Bim-L、Bim-exL的表達逐漸上調。見圖3。

圖3 克唑替尼（300 nmol/L、1 000 nm ol/L）對H 2228細胞和H 2228/CR細胞培養(yǎng)72 h后的W estern blot法檢測結果

3 討論

非小細胞肺癌的靶向治療已成為近年來研究的熱點，EML4-ALK融合基因陽性的非小細胞肺癌作為近期發(fā)現的一種新的肺癌亞型，其在肺癌中的發(fā)生率為3%～7%［5］。包括克唑替尼在內的以EML4-ALK為靶點的分子靶向藥物，在治療含有ALK融合基因的肺癌患者中取得較好的療效，但一部分患者產生獲得性耐藥。目前對于克唑替尼耐藥機制尚未完全闡明，有文獻報道如基因二次突變（C1156、L1196等）、表皮向間質轉化等都能引起耐藥的發(fā)生［6，7］。本研究通過克唑替尼濃度遞增法建立H2228/CR耐藥細胞株，以MTT法計算H2228/CR的耐藥指數為10.20，從而為后續(xù)耐藥機制的研究奠定了良好基礎。

BIM作為一種促凋亡因子，是bcl-2家族中HB3 only亞家族的成員［8］。其促凋亡作用主要與抗凋亡家族成員如bcl-2、bcl-xL相結合形成二聚體或多聚體的形式，在線粒體膜上引起細胞色素C釋放，從而導致細胞死亡［9］。BIM在穩(wěn)定造血細胞的內環(huán)境、調節(jié)免疫系統(tǒng)、腫瘤的發(fā)生等發(fā)揮關鍵作用［10］。我們的研究發(fā)現克唑替尼對H2228細胞有誘導凋亡作用，且呈時間依賴性。以克唑替尼作用72 h后檢測H2228細胞中ALK、ERK的活化形式p-ALK、p-ERK蛋白的表達量下降，并隨克唑替尼濃度增加呈下降趨勢，而BIM蛋白的表達量增加。我們推測克唑替尼對H2228細胞的促凋亡作用與MAPK/MEK/ERK信號通路有密切關系?，F已知活化的ERK通過磷酸化Bim-exL的Ser導致BIM被蛋白酶體降解，引起B(yǎng)IM表達水平下調［11］。本實驗結果顯示H2228細胞p-ERK蛋白表達下調時，BIM蛋白表達量增加。由此說明克唑替尼通過抑制ALK磷酸化來抑制下游信號通路MAPK/ MEK/ERK的激活來上調BIM蛋白的表達，從而促進H2228細胞凋亡，這與Luciano等［11］的研究一致。

在獲得H2228/CR耐藥細胞后發(fā)現克唑替尼對其不具有誘導凋亡的作用，而且活化的p-ALK表達未受到抑制，下游通路中的p-ERK蛋白表達未見下降，促凋亡蛋白BIM未見上調。目前引起克唑替尼耐藥機制主要有ALK激酶區(qū)域突變、信號傳導旁路的激活、ALK融合基因拷貝數目的增加等［12］?，F公認的耐藥機制是激酶區(qū)域ATP結合位點的突變［13］，這可能是本實驗中導致H2228細胞耐藥的原因。Katayama等［14］研究發(fā)現在ALK融合基因肺癌細胞中ATP結構域的gatekeeper處檢測到L1196M突變，使ALK空間構象發(fā)生改變阻止克唑替尼結合。本實驗中p-ALK持續(xù)活化可能是由于ALK激酶區(qū)突變阻礙克唑替尼與ALK結合導致，從而激活下游通路，抑制促凋亡蛋白BIM的增加。Song等［15］通過對表皮生長因子受體（EGFR）突變的肺腺癌耐藥細胞株研究發(fā)現，單獨使用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）時，下游通路MAPK/MEK/ ERK仍能再次被激活，說明下游信號傳導可能繞過EGFR靶點向下傳導產生耐藥。另外，Ng等［16］研究證實BIM基因缺失多態(tài)性與吉非替尼耐藥有關，在EGFR基因突變患者中，有BIM基因多態(tài)性患者對吉非替尼的療效較無BIM多態(tài)性者差。這些耐藥機制是否與本實驗有關還需進一步研究。

本研究表明，BIM在誘導EML4-ALK陽性表達的人肺腺癌細胞株H2228對克唑替尼產生耐藥發(fā)揮重要作用，闡明了EML4-ALK陽性表達的非小細胞肺癌克唑替尼耐藥產生的可能機制，提示BIM可作為克服克唑替尼耐藥的一個靶點，為未來逆轉耐藥提供了新的思路。本實驗存在一些不足之處，有待今后研究進一步完善，如利用基因干擾技術抑制BIM基因蛋白的表達，以同樣條件的克唑替尼處理沉默BIM基因前后的H2228細胞，檢測細胞凋亡情況，以進一步闡明BIM在H2228/CR耐藥細胞中的作用。有關方面有待深入研究。

［1］ K w a k EL，B ang Y J，C ami d ge DR，e t a l.A nap l a st ic l ymph o ma k ina s e inhi b i t i o n in n o n-s ma ll-ce ll l ung cance r［J］.N E ng l J M e d，2010，363（18）：1693-1703.

［2］ Gan d hi L，J?nne P A.C r i zot ini b for ALK-r ea rr ange d n o n-s ma ll ce ll l ung cance r：a ne w t a r ge t e d t he r apy for a ne w t a r ge t［J］.C l in C ance r R e s，2012，18（14）：3737-3742.

［3］ H euc k mann J M，H olz e l M，Sos ML，e t a l.ALK mu t a t i o n s c o n f e rr ing d i ff e r en t ia l r e s i st ance to str uc t u r a ll y d i v e rs e ALK inhi b i tors［J］.C l in C ance r R e s，2011，17（23）：7394-7401.

［4］ X i o ng H，W ang J，Guan H，e t a l.S ph K1 c o n f e rs r e s i st ance to ap o ptos i s in ga str ic cance r ce lls b y dow n r egu l a t ing B im v ia st imu l a t ing A kt/F o x O3a s igna l ing［J］.O nc ol R ep，2014，32（4）：1369-1373.

［5］ H or n L，P a oW.EML4-ALK：h o ning in o n a ne w t a r ge t in n o n-s ma llce ll l ung cance r［J］.J C l in O nc ol，2009，27（26）：4232-4235.

［6］ K im H R，K im WS，C h o i Y J，e t a l.E pi t he l ia l-me s enchyma l tr an s i t i o n l ea ds to c r i zot ini b r e s i st ance in H2228 l ung cance r ce llsw i t h EML4-ALK tr an slo ca t i o n［J］.M ol O nc ol，2013，7（6）：1093-1102.

［7］Z hang S，W ang F，K ea ts J，e t a l.C r i zot ini b-r e s i st an t mu t an ts of EML4-ALK i d en t i f ie d t h ro ugh an acce l e r a t e d mu t agene s i s s c r een［J］.C hem B i ol D r ug D e s，2011，78（6）：999-1005.

［8］ D e l ga do M，T e sf aig z iY.BH3-o n l y p rot ein s，B m f an d B im，in au to phagy［J］. C e ll C yc l e，2013，12（22）：3453-3454.

［9］ L ee E F，C z a bot a r P E，S mi t h B J，e t a l.C r y st a l str uc t u r e of AB T-737 c o mp l e x e d w i t h B c l-x L：imp l ica t i o n s for s e l ec t i v i t y of an t ag o ni sts of t he b c l-2 f ami l y［J］.C e ll D ea t h D i ff e r，2007，14（9）：1711-1713.

［10］A k iyama T，T ana k a S.B im：gua rd ian of t i ss ue h o me ost a s i s an d c r i t ica l r egu l a tor of t he immune s y st em，t um or igene s i s an d bo ne b i olo gy［J］. A r ch I mmun ol T he r E x p（W a rsz），2011，59（4）：277-287.

［11］L ucian o F，J ac q ue l A，C olos e tt i P，e t a l.P h os ph or y l a t i o n of B im-EL b y E rk1/2 o n s e r ine 69 p ro m ot e s i ts d eg r a d a t i o n v ia t he p rot ea so me pa t h w ay an d r egu l a t e s i ts p ro ap o p tot ic f unc t i o n［J］.O nc o gene，2003，22（43）：6785-6793.

［12］ W u D，Yu H，L i J.M echani s m s of r e s i st ance to EML4-ALK inhib i tors in n o n-s ma ll ce ll l ung cance r［J］.Z h o nggu o F ei A i Z a Z hi，2013，16（1）：48-53.

［13］S a s a k i T，K o i v unen J，O gin o A，e t a l.A n ov e l ALK s ec o n d a r ymu t a t i o n an d E G FR s igna l ing cau s e r e s i st ance to ALK k ina s e inhi b i tors［J］. C ance r R e s，2011，71（18）：6051-6060.

［14］ K a t ayama R，K han T M，B ene s C，e t a l.T he r apeu t ic str a t egie s to ov e r c o me c r i zot ini b r e s i st ance in n o n-s ma ll ce ll l ung cance rs ha rboring t he f u s i o n o nc o gene EML4-ALK［J］.Pro c N a tl A ca d S ci U S A，2011，108（18）：7535-7540.

［15］ So ng J Y，K im C S，L ee J H，e t a l.D ua l inhi b i t i o n of MEK1/2 an d E G FR s yne r gi st ica ll y in d uce s ca s pa s e-3-d epen d en t ap o p tos i s in E G FR inhi b i tor-r e s i st an t l ung cance r ce lls v ia BIM up r egu l a t i o n［J］. I n v e st N e w D r ug s，2013，31（6）：1458-1465.

［16］N g K P，H i ll me r AM，C huah C T，e t a l.A c o mm o n BIM d e l e t i o n p ol ym or phi s m me d ia t e s in tr in s ic r e s i st ance an d in f e r i or r e s p o n s e s to t yros ine k ina s e inhi b i tors in cance r［J］.N a t M e d，2012，18（4）：521-528.

［2014-10-24收稿］［2014-11-25修回］［編輯 阮萃才］

Role of BIM signaling in crizotinib-induced apoptosis in the EM L4-ALK-positive lung adenocarcinom a cell line H 2228

WEI Jiang1，2，PENG Haiyan1，2，SU Cuiyun1，SONG Xiangqun1，WANG Huilin1，NING Ruiling1，ZHOU Shaozhang1（1Department of Chemotherapy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHOU Shaozhang.E-mail：179913337@qq.com

Objective To establish a crizotinib-resistant line of the EML4-ALK-positive lung adenocarcinoma cell line H2228 and compare it with the crizotinib-sensitive parental line to examine the possible role of BIM in crizotinib-induced apoptosis.M ethods H2228 human lung cellswere exposed to gradually increasing doses of crizotinib（50，100，200，500，1000 nmol/L）to create a crizotinibresistant line（H2228/CR）.Then H2228/CR and parental H2228 cellswere exposed to different doses of crizotinib，and their growth was compared using the MTT assay，while levels of apoptosiswere compared using flow cytometry.Western blottingwas used to compare levels of ALK，p-ALK，ERK，p-ERK and BIM in the two cell lines.Results After 8 months of crizotinib selection，the resistant lineH2228/CR showed an IC50of 3，418 nmol/L compared to 335 nmol/L for the parental H2228 line.The RI for H2228/CR cells was 10.20.Crizotinib inhibited the growth of H2228/CR cells to a much smaller extent than it inhibited H2228，and it led to a much smaller proportion of apoptotic cells in H2228/CR cultures.Levels of phospho-ERK were higher in H2228/CR cells，implying downregulation of BIM.Conclusion BIM may help mediate crizotinib-induced apoptosis in lung cancer，and its down-regulation may contribute to crizotinib resistance.

Lung neoplasm；EML4-ALK fusion gene；H2228 cell；Crizotinib；Acquired resistance；BIM

R734.2

A

1674-5671（2015）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.01

國家自然科學基金資助項目（81260357）

周韶璋。E-mail：179913337@qq.com