李松濤 高立霞 張麗君 曹宏偉 孔青

(山東醫(yī)藥技師學(xué)院,山東泰安 271016)

基于隨機(jī)引物PCR的幾種分子標(biāo)記技術(shù)的概述

李松濤 高立霞 張麗君 曹宏偉 孔青

(山東醫(yī)藥技師學(xué)院,山東泰安 271016)

本文綜述了各種基于隨機(jī)引物PCR(Polymerase Chain Reaction)的分子標(biāo)記技術(shù),包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、任意引物PCR(Abitrary Primer PCR,AP-PCR)、DNA?擴(kuò)增指紋分析(DNA Amplification Fingerprinting,DAF)以及此后在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的其他技術(shù),如序列特異性擴(kuò)增(sequence characterized amplified region,SCAR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-based amplified polymorphism, SRAP)等,就以上分子標(biāo)記技術(shù)的原理、操作步驟、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡要概述。

分子標(biāo)記 RAPD AP-PCR SCAR

隨著分子生物學(xué)研究的逐漸深入，越來越多的分子標(biāo)記技術(shù)被人們發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用，這些技術(shù)反過來又促進(jìn)了分子生物學(xué)的發(fā)展。目前，分子標(biāo)記技術(shù)按實驗方法不同可分為：基于分子雜交的分子標(biāo)記技術(shù)，基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，和基于特異引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)?；陔S機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于物種鑒別、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析等研究領(lǐng)域。

基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代初。1990年美國杜邦公司williams等用10堿基的寡核苷酸作為引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA成功，并將此技術(shù)命名為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Randomly Amplifi ed Polymorphic DNA，RAPD)[1]。同時期，Welsh和McClelland發(fā)明了AP-PCR[2]，Caetano-Anolles發(fā)明了DAF[3]。

RAPD、AP-PCR、DAF三種技術(shù)極為相似，都是利用PCR，以隨機(jī)序列寡核苷酸為引物，對目標(biāo)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增。當(dāng)然它們之間也存在一些差別，比如三種技術(shù)的隨機(jī)引物長度有所不同。三種技術(shù)中，RAPD更為常用。Franck A.Atienzar等人曾統(tǒng)計，自1990年至2005年，OVID數(shù)據(jù)庫收載的有關(guān)RAPD的論文高達(dá)8493篇，而AP-PCR、DAF分別約為500篇和150篇[4]。

1 RAPD技術(shù)

1.1 技術(shù)原理

基因組中存在著豐富的反向重復(fù)序列，根據(jù)這一特點(diǎn)，RAPD利用隨機(jī)的寡核苷酸片段作為單一引物對基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。單一引物與上下游的反向重復(fù)序列結(jié)合，兩位點(diǎn)之間的DNA序列就被擴(kuò)增出來，形成此基因組特異的DNA片段。很多從同一基因組DNA上擴(kuò)增出來的不同分子量的條帶構(gòu)成了這個基因組的DNA指紋。不同來源的基因組，DNA指紋不同，此即DNA多態(tài)性。RAPD結(jié)果的多態(tài)性源自被擴(kuò)增區(qū)域的染色體不同或引物結(jié)合位點(diǎn)的堿基改變。

雖然一條引物檢測的多態(tài)性有限，但是RAPD實驗通常利用多條引物分別對DNA擴(kuò)增，因而檢測區(qū)域可能覆蓋整個基因組。

1.2 操作步驟

RAPD實際上是一種特殊的PCR，與普通PCR不同之處在于其選用單一隨機(jī)引物，且退火溫度較低?；静襟E可概括為：(1)提取基因組DNA；(2)用10堿基的隨機(jī)引物，對基因組DNA進(jìn)行PCR。PCR條件各實驗室有所不同，退火溫度一般在36℃左右，循環(huán)數(shù)一般為40-45個循環(huán)。(3)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并在紫外燈下觀察。(4)分析結(jié)果。記錄各物種多態(tài)性條帶的1/0數(shù)據(jù)，用spss軟件計算任意兩物種間的相似性系數(shù)，或PAUP軟件進(jìn)行聚類分析，建樹狀聚類圖。

1.3 優(yōu)缺點(diǎn)

與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，RAPD具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)RAPD不需高端實驗設(shè)備，只要PCR儀和電泳裝置即可滿足實驗要求。RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)需要進(jìn)行southern blotting、同位素標(biāo)記等復(fù)雜或放射性實驗[5，6]。相比之下，RAPD實驗操作更簡便安全。(2)RAPD的分析對象DNA，在生命體中廣泛存在易獲取。提取植物DNA，一般不需考慮葉片采集時間，但幼葉中酚的含量較少易于純化。此外，RAPD所需DNA量相對較少，且蛋白質(zhì)、RNA污染對實驗結(jié)果影響不大[7]。(3)引物設(shè)計簡易，無需知道基因組DNA信息，隨機(jī)設(shè)計10堿基的寡核苷酸序列即可作為引物。(4)由于RAPD所用的隨機(jī)引物，有些可以擴(kuò)增DNA的高度保守序列，因此可以將多樣性定在較高分類水平。同樣，有些引物擴(kuò)增的是DNA的高度可變區(qū)，因而可以用于低水平的種間或種內(nèi)多樣性分析。

盡管RAPD有著諸多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一些缺陷：首先，RAPD是顯性標(biāo)記，無法有效區(qū)分基因組DNA為純合子還是雜合子；其次，通過RAPD可鑒別出基因多態(tài)性，卻無從知道多態(tài)性位點(diǎn)，也不能確定此位點(diǎn)基因是否影響生物體表型；最重要的是，相對于其他分子標(biāo)記實驗，RAPD技術(shù)的可重復(fù)性較低[8]。因此，實驗中還需摸索DNA含量、模板含量退火溫度等信息，以提高可重復(fù)性[8，9]。

2 AP-PCR技術(shù)

AP-PCR是同時期發(fā)現(xiàn)的與RAPD相似的技術(shù)。與RAPD相比，AP-PCR引物稍長，一般為20個堿基，且濃度是RAPD的10倍。此外，AP-PCR的PCR操作略顯復(fù)雜，其過程可分為兩個階段。第一個階段，低嚴(yán)謹(jǐn)條件下的擴(kuò)增。此階段的退火溫度較低，因而引物與模板結(jié)合時錯配較多，這一階段進(jìn)行兩個循環(huán)。第二階段，高嚴(yán)謹(jǐn)條件下的擴(kuò)增。此階段退火溫度高，約為60℃，在低嚴(yán)謹(jǐn)退火條件下發(fā)生的延伸引物可以繼續(xù)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。為了得到更清晰的結(jié)果，在反應(yīng)最后的20到30個循環(huán)還可加入放射性的32-PdCTP。

AP-PCR最顯著的特點(diǎn)是兩個低嚴(yán)格性的退火循環(huán)，它使PCR的錯配處在一個較高的水平，這樣檢測的多態(tài)性更豐富。另外，在有些實驗中采用放射性的dCTP作原料，合成DNA條帶具有放射性。

3 DAF技術(shù)

DAF，也是與AP-PCR、RAPD同時期發(fā)現(xiàn)的原理相似的分子標(biāo)記技術(shù)。DAF的單一引物長度更短，一般在5-8個堿基之間，因此多態(tài)性更大。條帶比RAPD和AP-PCR都多，因而檢測出樣本之間多態(tài)性的可能性會增加。

4 SCAR技術(shù)

SCAR(sequence characterized amplified region，序列特異性擴(kuò)增)是以RAPD為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。與RAPD相比其優(yōu)勢在于，可以確定多態(tài)性DNA條帶的堿基序列，并將顯性標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性標(biāo)記，因此在遺傳學(xué)上具有重要意義。

在SCAR中，首先要進(jìn)行RAPD-PCR，擴(kuò)增出產(chǎn)物后，切割感興趣的條帶并進(jìn)行測序，然后根據(jù)測定序列在原引物3’端添加14個堿基，構(gòu)成24堿基的引物再進(jìn)行擴(kuò)增。SCAR因引物更長，退火溫度高，引物與模板結(jié)合更具特異性，結(jié)果也更準(zhǔn)確。SCAR是共顯性標(biāo)記，如果要做顯性標(biāo)記則第二次PCR之后只需染色、不用電泳。

SCAR主要用于將RAPD顯性標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性標(biāo)記，以確定基因組是否為純合子。謝傳曉等人把與玉米對生葉突變體對生性狀兩個顯性位點(diǎn)緊密連鎖的RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，為對生玉米的分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)[10]。在某些情況下，為了增加實驗的穩(wěn)定性和可靠性，也可將RAPD轉(zhuǎn)化為SCAR，如吳學(xué)謙等將SCAR標(biāo)記用于香菇菌株鑒定上，構(gòu)建了穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒定香菇菌株的新方法[11]。

5 SRAP技術(shù)

SRAP(sequence-based amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)，又稱為SBAP(sequence-based amplified polymorphism，基于序列擴(kuò)增多態(tài)性)，是于2001年由美國加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士建立起來的對外顯子進(jìn)行分析的技術(shù)[12]。

SRAP與RAPD的最大不同在于其獨(dú)特的引物設(shè)計。SRAP基于外顯子富含GC而啟動子和內(nèi)含子富含AT的特點(diǎn)來設(shè)計引物，以實現(xiàn)對開放閱讀框架(ORF)進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP所用為一對引物而不是單一引物：上游引物5’端前10個為填充序列，接著是CCGG，3’端是三個選擇堿基；下游引物5’端前11個是填充序列，接著是AATT，3’端是三個選擇堿基。引物的設(shè)計是SRAP實驗成功的關(guān)鍵：上游引物、下游引物的長度必須不同，且應(yīng)注意引物內(nèi)、引物間不能形成“發(fā)夾”等二級結(jié)構(gòu)。

SRAP多態(tài)性主要來自于兩方面：一方面，插入和缺失導(dǎo)致的片段長度的改變由此產(chǎn)生的多態(tài)性，此時SRAP可用做共顯性標(biāo)記；另一方面，核苷酸改變而產(chǎn)生的多態(tài)性，此時SRAP只能用作顯性標(biāo)記。

6 RAMPO

RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism，隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性)，又稱為RAHM(random amplifi ed hybridization microsatellites，隨機(jī)擴(kuò)增雜交微衛(wèi)星)。為了從RAPD中獲得更多的多態(tài)性信息，在PCR擴(kuò)增之后，用SSR探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行southern印跡，這一方法被稱為RAMPO或RAHM[13]。SSR探針主要結(jié)合在擴(kuò)增產(chǎn)物的微衛(wèi)星序列上，因此RAMPO可以從RAPD凝膠上獲得更多有關(guān)微衛(wèi)星基因克隆的信息。

7 MS-RAPD(Methylation-Sensitive Random Amplified Polymorphic DNA,甲基敏感隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)

通常DNA多態(tài)性是指堿基序列的多態(tài)性，但是DNA的甲基化在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。目前，有很多檢測DNA甲基化的技術(shù)，如，亞硫酸氫鹽測序(bisulfi te sequencing)，甲基化CPG島復(fù)原分析(MIRA)，甲基敏感多態(tài)性擴(kuò)增等。其中甲基敏感多態(tài)性擴(kuò)增就是一種基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，它包括MSAP-PCR[14]和MS-RAPD[15，16]。

在進(jìn)行MS-RAPD時，首先利用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶MSPⅠ、HapⅡ?qū)NA進(jìn)行切割，然后將獲得的DNA片段進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增得到多態(tài)性DNA。MS-AP-PCR與MS-RAPD技術(shù)極為相似，不同在于MS-RAPD最后檢測時采用瓊脂糖膠，而MS-AP-PCR采用測序凝膠。

8 結(jié)語

分子標(biāo)記作為新的遺傳標(biāo)記，具有簡單、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定和易測序等的優(yōu)點(diǎn)。其中基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記，由于不需要合成特定引物就可以檢測DNA的多態(tài)性，并且不依賴于基因組結(jié)構(gòu)和種屬特異性，現(xiàn)已在物種鑒別、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

雖然基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)顯示出了它獨(dú)特的優(yōu)越性，但目前尚未發(fā)現(xiàn)任何一種分子標(biāo)記技術(shù)可以滿足作為理想的遺傳標(biāo)記的所有要求。因此在實驗過程中我們往往需要結(jié)合其他分子標(biāo)記，使之可以快速構(gòu)建高飽和度的遺傳圖譜。不過可以預(yù)見的是基于隨機(jī)引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)將在一定時期內(nèi)得到長足發(fā)展，有一個更廣闊的應(yīng)用前景。

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