趙飛 高廣慧 崔松林

【摘 要】 本文闡述了建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測動物源性食品中氯霉素含量的分析方法。該方法快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于動物源性食品中氯霉素的檢測。

【關(guān)鍵詞】 UPLC-MS/MS 氯霉素 動物源性食品

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.006

氯霉素是一種廣譜、強效抗生素，常被非法用于養(yǎng)殖業(yè)中。氯霉素一般較為穩(wěn)定，不易降解，且其具有誘變、致癌的特性，及對人體造血機能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此被世界多數(shù)國家列為禁用物質(zhì)。我國食品動物禁用獸藥清單中，氯霉素位列其中。因此氯霉素的高靈敏檢測對于保證動物源性食品的安全等具有重要意義。

常用的氯霉素檢測方法有液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。本文通過優(yōu)化樣品前處理條件及色譜-質(zhì)譜條件，建立了動物源性食品中氯霉素殘留的檢測方法，本方法可為動物源性食品中氯霉素殘留的定性定量分析提供有力的技術(shù)支撐，亦可以為動物源性食品中其他獸藥殘留的檢測分析提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WATERS TQD超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國沃特世公司）；渦旋混合器（德國IKA）；氮吹濃縮儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素（chloramphenicol， CAP），氘代氯霉素（D5-chloramphenicol，D5-CAP）。

乙腈（色譜純，美國FISHER公司），正己烷（色譜純，美國FISHER公司），實驗用水為一級水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取適量氯霉素和氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以甲醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于棕色容器中，于-18℃冰箱中保存。將上述儲備溶液分別用甲醇逐級稀釋成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，用于優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。以10%甲醇溶液為溶劑將標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋配制為含有氘代氯霉素的質(zhì)量濃度為2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 樣品前處理

（1）提取準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)后的動物源性食品5.0g（精確至0.01g），分別加入相當(dāng)于10ng的氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液，置于50mL帶有螺旋蓋的離心管中，精密加入25mL乙酸乙酯，1mL氨水，渦旋提取30s，加入無水硫酸鈉5g，渦旋30s后，于5000r/min離心10min。

（2）濃縮：精密移取上清液10mL于另一離心管中，40℃下空氣流吹干。

（3）復(fù)溶：殘渣用2mL10%乙腈溶液，渦旋1min，再加入1mL正己烷，渦旋混合，靜置待分層后，取下層經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測。

1.4 UPLC色譜條件

Waters超高效液相色譜柱：ACQUITY UPLC BEH1.7μm2.1×50mm；流動相：乙腈（A），水（B），梯度洗脫程序見表1；柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：0.4mL/min。

表1 梯度洗脫程序

1.5 MS/MS質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化；掃描方式：負(fù)離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：2.5kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：800L/h；錐孔反吹氣流量：50L/h；質(zhì)量條件參數(shù)見表2。

表2 MRM分析的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

本文中氯霉素的檢測采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，選用色譜填料粒徑為1.7μm的C18超高效液相色譜柱，與常規(guī)的色譜柱相比，因粒徑大大減小，使單位體積填料的表面積大大增加，進(jìn)而增加了理論塔板數(shù)，柱效明顯優(yōu)于普通色譜柱，色譜分離時間大大降低，提高了分析檢測的速度。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

取標(biāo)準(zhǔn)使用液作為進(jìn)行質(zhì)譜條件選擇的測試液，根據(jù)氯霉素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，選擇電噴霧離子化負(fù)離子掃描模式，對毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣流量、通過一級全掃描觀察總離子流圖，找到精確的分子離子峰，優(yōu)化錐孔電壓等條件使分子離子峰響應(yīng)最好；在上面基礎(chǔ)上，通過逐步增加碰撞能量，找到精確的子離子，氯霉素的分子離子峰為[M+H]+（m/z320.9），選擇子離子151.9和256.9分別作為定量離子和定性離子，氘代氯霉素的分子離子峰為326.1，選擇157.0作為內(nèi)標(biāo)離子。通過優(yōu)化碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)，使各子離子的靈敏度達(dá)到最優(yōu)，定量分析多反應(yīng)離子監(jiān)測的最優(yōu)化參數(shù)見表2。

2.3 方法的線性及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列濃度依次為0.5、1、2、4、8（ng/mL），內(nèi)標(biāo)物氘代氯霉素的濃度為2ng/mL，依次進(jìn)樣測試，進(jìn)樣量均為5μL，經(jīng)工作站軟件計算各子離子峰面積及氯霉素定量離子與氘代氯霉素定量離子的峰面積比值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用內(nèi)標(biāo)法定量，得到回歸方程為Y=0.667X-0.026，相關(guān)系數(shù)r=0.9995（見圖1）。

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線（內(nèi)標(biāo)法）

2.4 方法的檢出限

以產(chǎn)生3倍信噪比時的樣品中氯霉素的濃度為最低樣品檢出限，得到本方法的樣品最低檢出限為0.05μg/kg（見圖2）。

圖2 本法樣品最低檢出限的信噪比

2.5 方法的精密度和準(zhǔn)確度試驗

以樣品響應(yīng)值低于樣品最低檢出限的樣品作為本底樣品6份，分別加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，按樣品前處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測試，分別計算回收率和精密度，得出回收率在95%～110%之間，RSD小于5.0%，測定結(jié)果見表3。

表3 方法的精密度和準(zhǔn)確度試驗（n=6）

2.6 實際樣品的測定

以購買的產(chǎn)品編號為ERM-BB130豬肉中的氯霉素含量質(zhì)控樣品作為測試樣品，證書給出的氯霉素參考值范圍是（0.209～0.251）μg/kg，按本法檢測結(jié)果為0.240μg/kg，檢測結(jié)果在證書的參考值范圍內(nèi)，結(jié)果滿意。

3 小結(jié)

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法檢測動物源性食品中氯霉素含量具有以下優(yōu)勢：超高效液相色譜完成氯霉素的測定僅需3min，極大縮短了分離分析時間，且低流速可以減少流動相的消耗，降低成本；樣品的前處理并沒有經(jīng)固相萃取柱凈化直接進(jìn)樣，操作簡便快速，并以內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度較高，適用于大批量樣品的檢測；電噴霧三重四級桿多反應(yīng)離子監(jiān)測選擇性更好，抗干擾能力更強，方法的靈敏度更高。

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作者簡介

趙飛，工程師，碩士，主要從事食品和化妝品檢測方法開發(fā)與研究工作。

高廣慧，碩士，從事食品和化妝品檢測方法開發(fā)與研究。

崔松林，學(xué)士，從事食品和化妝品檢測方法開發(fā)與研究。

（責(zé)任編輯：張曉明）