馬琪 陳俊豐 蔣軍輝 王平 蔣照輝 程躍

[摘要] 目的 建立鼠源性HSP70、GM-CSF雙修飾前列腺癌全細胞疫苗。 方法 通過化學合成和PCR方法分別構建小鼠Hspa1a、Csf2基因片段，TA克隆入pMD-18T載體測序驗證。上述合成好的目的序列通過限制性內切酶BamHI/AscI酶切、T4DNA連接酶連接，分別裝入慢病毒表達載體pLenti6.3_MCS中，構建慢病毒重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5。載有重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5的慢病毒液分別對鼠前列腺癌細胞系RM-1進行穩(wěn)定轉染或共轉染，Western blot檢測蛋白表達，10 Gy放射線照射使其喪失增殖能力后凍存。 結果 測序驗證重組慢病毒表達載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5構建成功。經293T細胞包裝后分別或共轉染RM-1，Western blot證實GM-CSF、sHSP70表達，GM-CSF和HSP70共表達。 結論 本實驗成功建立了鼠HSP70、GM-CSF雙修飾RM-1細胞全細胞疫苗，為以后進一步探討全細胞抗原作用機制和全細胞免疫增強機理奠定基礎。

[關鍵詞] 熱休克蛋白；巨噬細胞集落刺激因子；前列腺癌全細胞疫苗

[中圖分類號] R730.3；R735.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）19-0001-04

去勢抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer， CRPC）是當前前列腺癌診治中的熱點和難點。目前，利用免疫技術治療CRPC發(fā)展迅速，基于樹突狀細胞疫苗、全細胞腫瘤疫苗、細胞因子、抗體等多種方法在CRPC得到應用。其中樹突狀細胞疫苗APC 8015已于2010年通過FDA審批，并進入NCCN指南，成為前列腺癌免疫治療領域的重要進展之一[1]。而與樹突狀細胞疫苗同期進入Ⅲ期臨床試驗的全細胞疫苗GVAX則未獲通過。 本研究擬在前列腺癌全細胞疫苗GVAX基礎上，進一步利用熱休克蛋白70 （Hsp70）進行修飾，利用全細胞疫苗和熱休克蛋白疫苗在理論上所具有的良好協(xié)同機制，發(fā)展新型全細胞前列腺癌治療性疫苗，為以后進一步探討全細胞抗原作用機制和全細胞免疫增強機理奠定基礎，報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

鼠前列腺癌細胞系RM-1細胞株購自于中科院上海細胞庫，293T由本實驗室保存；pMD18-T 載體購自Takara公司；限制性內切酶BamHI和AscI，T4 DNA連接酶購自NEB公司；感受態(tài)細胞DH5α購自北京全式金公司；platinum Pfx DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、慢病毒載體pLenti6.3-MCS、包裝質?；旌衔颲iraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、轉染試劑lipofectamine 2000、Opti-MEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶0.25% Trypsin-EDTA均購自life technologies公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、標簽抗體兔抗鼠Myc均購自cell signaling 公司；標簽抗體兔抗鼠V5購自Abcam 公司；HRP標記羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司；BCA蛋白測量試劑盒Thermo scientific公司；增強型化學發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 TA克隆 根據(jù)Genbank中 Hspa1a（NM-010479.2）和Csf2（NM-009969.4）的基因信息，對所需合成的目的序列進行分析，檢查基因內部有無特別復雜二級結構和重復序列連接。根據(jù)基因序列分析的結果，分別進行單鏈oligo的設計及化學合成。利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因序列（其中目的序列Hspa1a末端插入標簽蛋白cMyc基因序列，Csf2末端插入標簽蛋白V5基因序列）。將合成好的序列裝入pMD18-T載體并轉化至感受態(tài)細胞DH5a。測序驗證重組克隆中插入序列是否與要求相一致。本部分內容由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2.2 亞克隆 BamHI/AscI雙酶切TA克隆的目的片段，37℃酶切2 h，酶切體系為：10×buffer 5 μL，目的片段10 μL（約1 μg），BamHI 1μL，AscI 1 μL，ddH2O 23 μL。用BamHI/AscI把pLenti6.3_MCS進行酶切，37℃酶切2 h，酶切體系為：10×buffer 5 μL，pLenti6.3_MCS 2 μL（約1 μg），BamHI 1 μL，AscI 1 μL，ddH2O 41 μL。電泳，回收酶切的目的片段。T4 DNA連接酶連接回收的片段與載體，室溫連接2 h，連接體系如下：連接緩沖液1 μL，慢病毒載體1 μL，目的片段2 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。取5 μL連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5a。從轉化的平板上挑去多個陽性單克隆進行測序驗證。

1.2.3 慢病毒的包裝與病毒滴度測定 取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細胞，細胞計數(shù)后，按照每個10 cm的培養(yǎng)皿6×106個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天轉染前移去培養(yǎng)液，添加5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液，取9 μg ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix和3 μg慢病毒表達質粒加入1.5 mL Opti-MEM（經37℃預熱）中輕輕混勻，取36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中輕輕混勻，室溫放置5 min；輕輕混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min。將3 mL質粒脂質體復合物小心地加入到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS。48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，3000 rpm 離心10 min，去除細胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過濾。將病毒原液在50000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，置于-80℃ 保存?zhèn)溆?，并留少量慢病毒測定物理滴度。利用逐孔稀釋滴度測定法和熒光定量PCR法測定病毒滴度。標準品原液和病毒原液各10 μL分別進行1∶10梯度稀釋，如取10 μL的慢病毒原液用無菌水稀釋100 μL，作為Lv-1，取10 μL Lv-1，用無菌水稀釋至100 μL，設為Lv-2，取10 μL Lv-2，用無菌水稀釋至100 μL，設為Lv-3，共計6個濃度。將標準品和各稀釋度的慢病毒樣品，通過實時熒光定量PCR檢測，并計算各稀釋液中的病毒滴度，如果三個稀釋度的CT值均在標準曲線范圍內，可取其平均值。

1.2.4 慢病毒感染RM-1細胞 取對數(shù)生長的RM-1細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到30%～50%時，加入慢病毒感染液進行實驗。實驗分成5組，分別為CON組（空白對照組）、NC組（空病毒載體感染組）、pLenti6.3_ MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_Hspa1a_ cMyc/pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體共感染組。預實驗明確pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組感染細胞的最佳感染復數(shù)（multiplicity of infection， MOI）值為8，pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體感染組最佳MOI值為10。根據(jù)預實驗最佳MOI值，在RM-1細胞中加入適量病毒，12 h后觀察細胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。

1.2.5 篩選穩(wěn)定表達 HSP70、GM-CSF、HSP70/GM-CSF的RM-1細胞株并經γ射線滅活后凍存慢病毒感染RM-1細胞48 h后，加入稻瘟菌素（Blasticidin，BSD） 4 μg/mL的選擇性培養(yǎng)基進行篩選，10～14 d后可見陽性克隆生長，挑去單細胞克隆，在24孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，大約4周左右可獲得穩(wěn)定轉染的克隆細胞。收集病毒穩(wěn)定感染的RM-1細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量檢測蛋白濃度。每個樣品取50 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳，經轉膜、封閉后一抗4℃過夜。兔抗鼠cMyc和V5一抗孵育后加入HRP標記的二抗，ECL發(fā)光，最后進行膠片曝光、顯影定影。10 GYγ射線照射穩(wěn)定感染慢病毒的RM-1細胞后，-80℃保存待用。

2 結果

2.1 慢病毒表達載體的構建與鑒定

目的片段Hspa1a與CSf2 的PCR產物經純化后分別與載體酶切、連接、轉化，挑取陽性菌落克隆進行菌液PCR鑒定測序后，用SECentral軟件與鼠Hspa1a（GenBank：NM-010479.2）、CSf2 cDNA（GenBank：NM_ 009969.4）序列比對，載體插入序列與Hspa1a、CSf2 cDNA序列一致（封三圖1A為Hspa1a部分測序序列，封三圖1B為CSf2部分測序序列），表明重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_CSf2_V5構建成功。

2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測定

將構建成功的質粒與包裝質?；旌衔锕厕D染293T細胞，采用利用逐孔稀釋滴度測定法和熒光定量PCR法測定病毒滴度。慢病毒pLenti6.3_MCS_ Hspa1a_cMyc濃縮后的病毒滴度測定計算結果為（5.04×108）TU/mL，慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5濃縮后的病毒滴度為（6×108）TU/mL。

2.3 慢病毒感染RM-1后Western blot檢測HSP70、GM-CSF蛋白的表達

慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc感染RM-1后提蛋白，以cMyc為抗原檢測融合蛋白Hspa1a_cMyc的表達，結果觀察到70～100 kDa之間有一條特異性條帶，其大小和Hspa1a_cMyc融合蛋白相符合（HSP70蛋白分量為70 kDa，cMyc標簽對目的蛋白分子量影響較小）（圖2A，第4泳道）；慢病毒pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5感染RM-1，以V5為抗原檢測融合蛋白CSf2_ V5的表達，結果觀察到25 kDa左右有一條特異性條帶，其大小和CSf2_V5融合蛋白相符合（鼠CSf2蛋白分子量為22 kDa）（圖2B，第3泳道）。慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc與pLenti6.3_MCS_CSf2-V5共感染RM-1，以cMyc為抗原檢測時，結果觀察到70～100 kDa之間有一條特異性條帶，以V5為抗原檢測時結果觀察到25 kDa左右有一條特異性條帶（圖2A，第5泳道；圖2B，第5泳道）。這些結果說明包裝產生的高滴度慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc、pLenti6.3_MCS_CSf2_V5感染細胞后能穩(wěn)定表達Hsp70和GM-CSF蛋白。

A：以cMyc為抗原檢測融合蛋白Hspa1a_cMyc的表達；B：以cMyc為抗原檢測融合蛋白Csf2_V5的表達。

1：空白對照；2：空載體對照；3：轉染慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5組；4：轉染慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc組；5：共轉染pLenti6.3_ MCS_CSf2_V5/pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc組

圖2 Western blot 檢測病毒穩(wěn)定感染RM-1后細胞中融合蛋白Hspa1a_cMyc、CSf2_V5、Hspa1a_cMyc/CSf2_V5的表達

3 討論

目前免疫治療已經成為前列腺癌治療中的熱點。多種疫苗、細胞因子和抗體已應用于前列腺癌的治療，并表現(xiàn)出了一定效果。目前已經進入臨床試驗和正在進一步發(fā)展的前列腺癌免疫治療的方法和專利包括樹突狀疫苗（如APC8015[2]，DCVax-Prostate[3]）、全細胞疫苗（如GVAX[4]）、DNA疫苗（Prostvac-VF[5]）、單克隆抗體（如MDX-010[6]，MK-3475[7]，J591[8]）等。

在諸多的免疫治療手段中，研究較多的是APC8015和GVAX。APC8015（sipuleucel-T，Provenge）是一種治療CRPC的樹突狀細胞疫苗，由于樹突狀細胞是一種最有效的抗原遞呈細胞，使樹突狀細胞疫苗成為前列腺癌免疫治療中的首選方式之一。研究者們在2010年6月報道了一項多中心的，隨機、對照、雙盲的臨床研究結果，在這項重要的研究里，與對照組比較，APC8015（又稱sipuleucel-T）降低了22%的激素抵抗性前列腺癌的死亡危險，36個月的生存概率sipuleucel-T較對照組高8.7%[2]。由于這個重要的結果，F(xiàn)DA批準sipuleucel-T在臨床上的使用[9]，sipuleucel-T是首個供臨床應用的前列腺癌治療性疫苗，也是近年來前列腺癌診治研究上最重要的進展[10-11]。

與sipuleucel-T同一階段進入Ⅲ期臨床試驗的還有全腫瘤細胞疫苗GVAX。GVAX即使用前列腺癌細胞系Lncap和PC3，經過基因修飾后，使其表達巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF）。GM-CSF是一種最強的樹突狀細胞活化因子，因而有利于樹突狀細胞在體內的局部聚集和活化，增強對前列腺癌抗原的識別和遞呈。在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中，GVAX能夠降低血PSA水平，延緩PSA再上升時間[12]。然而GVAX在Ⅲ期臨床試驗中卻令人失望。至2009年，相繼兩項大規(guī)模關于GVAX的Ⅲ期臨床試驗因效果不佳而被迫提前終止[13-14]。

與基于自體樹突狀細胞的腫瘤疫苗比較，基于腫瘤細胞株的全細胞疫苗有一定優(yōu)點。一方面，全細胞疫苗理論上含有腫瘤相關抗原（tumor associated antigens，TAAs），另一方面，無需針對每個患者進行單獨的個體疫苗制備，因而更適合規(guī)模制備和質量控制。然而，全細胞疫苗同樣存在明顯的缺點，那就是免疫原性不高，雖然經過基因改造增加局部GM-CSF表達，促進體內樹突狀細胞聚集、增殖和抗原遞呈功能，與樹突狀細胞疫苗比較，全細胞疫苗上仍然存在免疫原性差的問題。

在免疫識別過程中，HSP對抗原遞呈特別重要。特別是Hsp70，它能夠結合TAAs，將TTAs傳遞到APC表面與主要組織相容復合物（major histocompatibility complex， MHC-1）類分子結合，此后APC細胞通過相互遞呈機制，將腫瘤抗原識別信號遞呈給T細胞，激活細胞免疫。由于HSP70能夠結合多種TAAs，促進樹突狀細胞等APCs的識別和吞噬，并且提供免疫激活的關鍵信號[15]，以HSP70為基礎的治療性疫苗表現(xiàn)出一定提升腫瘤免疫的效果[16-17]。我們認為，HSP70的這個特性特別適合用于全細胞抗原的免疫增強。此外，樹突狀細胞含有熱休克蛋白受體，易于被樹突狀細胞識別捕獲，并進行處理和抗原遞呈，我們認為，HSP70的這個特性與GM-CSF的激活DCs的特性恰恰互補，一個激活抗原遞呈細胞，一個強化抗原遞呈過程?；贖SP70與GM-CSF在抗原識別與遞呈方面良好的協(xié)同作用機制，HSP70，GM-CSF雙修飾的激素非依賴性前列腺癌全細胞疫苗可能具有良好的治療效果。

慢病毒載體是在 HIV-1 病毒基礎上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，具有轉移效率高、其介導的基因表達持續(xù)穩(wěn)定、隨宿主細胞基因組分裂而分裂及適用范圍廣等優(yōu)點，已越來越受研究人員的青睞。本研究使用慢病毒載體載入鼠源性GM-CSF分子、sHSP70分子感染293T細胞后經測序驗證，成功構建慢病毒表達載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5；通過病毒包裝、收集和濃縮，得到了高滴度慢病毒顆粒；用于穩(wěn)定感染細胞后，Western blot 檢測到GM-CSF和HSP70的蛋白表達，成功獲得了鼠源性HSP70、GM-CSF雙修飾鼠前列腺癌全細胞疫苗。

綜上所述，本實驗成功建立了鼠RM-1細胞系全細胞疫苗，為日后發(fā)展進一步研究全細胞抗原作用機制，并為發(fā)展新型人源性前列腺癌疫苗建立基礎。

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（收稿日期：2015-02-10）