摘 要：對(duì)于使用激光掃描共聚焦顯微鏡的研究者來說，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品準(zhǔn)備、儀器操作和后期圖片處理是一個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要的四步，前兩步是任何一個(gè)研究者都必須具備的能力，否則無從談起上機(jī)實(shí)驗(yàn)，后期圖片處理無非就是修飾潤色使圖片從視覺上更美觀，而對(duì)大多數(shù)從事生物學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究者來說，儀器的操作可能是最關(guān)鍵的一步，而儀器操作中光路的設(shè)置和不同掃描模式的選擇可能是最難掌握和最難學(xué)習(xí)的模塊，因?yàn)檫@部分可能涉及一些物理光譜學(xué)的知識(shí)。文章就以自己實(shí)驗(yàn)室Zeiss LSM 780激光掃描共聚焦顯微鏡為例，簡要介紹其三種光路設(shè)置和五種不同掃描模式如何選擇使用，希望對(duì)使用者有所幫助。

關(guān)鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；光路設(shè)置；掃描模式

引言

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，各種熒光蛋白、熒光染料和精密光學(xué)元件不斷出現(xiàn)[1-5]，激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)得到了極大的發(fā)展，各種公司，各種型號(hào)的共聚焦系統(tǒng)不間斷問世或完善，廣泛應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6-8]。廣泛的應(yīng)用使得這一設(shè)計(jì)精密又操作復(fù)雜的儀器必須讓有需要的研究者方便學(xué)習(xí)和掌握。就以蔡司公司為例，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和適應(yīng)市場(chǎng)的需要，不同型號(hào)的共聚焦系統(tǒng)逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技術(shù)提高的同時(shí)，操作軟件也在一步步簡化。文章以華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的一臺(tái)超高靈敏度檢測(cè)Zeiss LSM 780系統(tǒng)為例，介紹其光路設(shè)置和不同掃描模式的選擇，因?yàn)樗悄壳安趟竟就瞥龅纳鲜銎胀す鈷呙韫簿劢癸@微鏡中型號(hào)最高的一款，它的光路設(shè)置和掃描模式的配置將集上述所有型號(hào)系統(tǒng)的內(nèi)置設(shè)置于一身，希望能給實(shí)驗(yàn)者提供較全面的指導(dǎo)。

1 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡三種光路設(shè)置

（1）最“傻瓜式”一鍵操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011軟件，軟件操作界面有一個(gè)Resue按鈕。如果使用者在此之前在這臺(tái)儀器上做過同樣的實(shí)驗(yàn)或本次實(shí)驗(yàn)與之前某次實(shí)驗(yàn)使用的熒光標(biāo)簽一樣或光譜數(shù)據(jù)類似，并且在此儀器上還保留有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，那只需在操作軟件中打開之前的一張圖片，然后點(diǎn)擊Reuse按鈕，軟件將自動(dòng)完成光路配置，并且光路中所有參數(shù)都是你打開的那張圖片的參數(shù)。（2）“傻瓜式”操作：如果使用者第一次使用該儀器，或本次實(shí)驗(yàn)與前面實(shí)驗(yàn)不使用同樣或光譜數(shù)據(jù)類似的熒光標(biāo)簽，又或者使用同樣的標(biāo)簽但在此儀器上沒有存留實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，那么需要在操作界面中找到一個(gè)Smart Setup按鈕，點(diǎn)擊打開Smart Setup對(duì)話框，在Configure your experiment表格中，在Dye列表下直接選擇熒光物質(zhì)名稱或在Search中輸入儀器自身存儲(chǔ)的熒光物質(zhì)的英文名稱，然后選擇它；在color列表下選擇偽彩色，然后點(diǎn)擊Apply，軟件將自動(dòng)完成光路配置，包括選擇相應(yīng)的激發(fā)光，主分光片，檢測(cè)PMT和收集熒光信號(hào)的發(fā)射帶寬，并將激光強(qiáng)度調(diào)至2.0。（3）手動(dòng)設(shè)置：對(duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者來說，這是最難的一種情況。如果你在“傻瓜式”操作步驟中Search不到你所使用的熒光物質(zhì)名稱（儀器自身存儲(chǔ)的熒光物質(zhì)名稱畢竟有限，并且新的熒光物質(zhì)和染料的開發(fā)也在不斷進(jìn)行中），并且也不知道它和哪種常見的熒光物質(zhì)的光譜數(shù)據(jù)相似，那么怎么辦你需要手動(dòng)設(shè)置光路，首先你需要查詢到你所使用的熒光物質(zhì)的光譜數(shù)據(jù)，包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜助你選擇合適的激發(fā)光來激發(fā)你的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，發(fā)射光譜指導(dǎo)你選擇合適的接收波長來接收發(fā)射的熒光，一般來說選擇激發(fā)峰附近的激發(fā)波長的激光來作為激發(fā)光，發(fā)射峰附件的波段作為接收熒光的波段最合適。

2 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡四種面掃描模式

使用兩種或兩種以上的熒光物質(zhì)時(shí)需要注意熒光物質(zhì)的光譜串色問題。在點(diǎn)擊Apply按鈕前，四種備選的面掃描模式供使用者選擇。

（1）Fastest：在各熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜不完全重疊的情況下，同時(shí)掃描多種熒光物質(zhì)，即在一個(gè)Track里多條激光線同時(shí)掃描，掃描成像速度是最快的，但可能出現(xiàn)信號(hào)串?dāng)_。（2）Best Signal：針對(duì)不同熒光物質(zhì)逐一進(jìn)行掃描成像，即一種熒光物質(zhì)使用一個(gè)Track，每條激光線順序掃描。盡可能減少各種熒光物質(zhì)發(fā)射光譜間的串?dāng)_，但掃描成像速度會(huì)明顯降低。（3）Best Compromise：綜合考慮成像速度和信號(hào)質(zhì)量，同時(shí)掃描發(fā)射光譜重疊較少的熒光物質(zhì)，即發(fā)射光譜重疊較少的熒光物質(zhì)使用一個(gè)Track，另一種物質(zhì)單獨(dú)使用一個(gè)Track。在減少信號(hào)串?dāng)_的前提下，在一定范圍內(nèi)提高成像速度。（4）Linear Unmixing：進(jìn)行多通道熒光掃描的光路設(shè)定，用于簡單的光譜拆分。

3 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡一種“隱藏”的線掃描模式

軟件默認(rèn)的掃描模式一般為面掃描模式，即在一個(gè)track完成整幅圖像的掃描后，切換至下一個(gè)track完成掃描，直至完成全部掃描。但對(duì)于活動(dòng)樣品來講，例如剛游離或濃度小的植物原生質(zhì)體樣品，在面掃描模式下，可能出現(xiàn)由于各Track掃描時(shí)間上的延遲而使各通道熒光信號(hào)無法完全重疊的現(xiàn)象。此時(shí)我們需要發(fā)現(xiàn)一種“隱藏”的線掃描模式，即一個(gè)track沿X軸方向完成一行掃描后，切換至下一個(gè)track完成掃描，直至所有track均完成此行掃描，掃描系統(tǒng)再移動(dòng)至下一行。如此重復(fù)，直至完成全部掃描。這種掃描方式盡可能地降低了各Track掃描時(shí)間上的延遲，為活動(dòng)樣品的掃描提供了解決方式。

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作者簡介：李華麗（1986-），女，漢族，河南人，碩士，實(shí)驗(yàn)員，主要從事科研儀器設(shè)備使用與實(shí)驗(yàn)室管理。