劉敏杰 方來(lái)福 胡萍萍 翁科娜 邊佳 毛佳瑜

[摘要] 目的 探討DyrklB在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 利用免疫組化檢測(cè)DyrklB在60例宮頸癌組織、60例宮頸癌癌旁組織和60例正常宮頸組織中的表達(dá)，分析DyrklB在宮頸癌組織中的表達(dá)狀況以及與宮頸癌臨床參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 Dyrk1B 在宮頸癌組織中的表達(dá)（60/60，100%）明顯高于癌旁組織（26/40，65%）和正常宮頸組織（16/40，40%），三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=88.21，P<0.01）。Dyrk1B的強(qiáng)陽(yáng)性率與宮頸癌的組織學(xué)分化程度有明顯相關(guān)性（P<0.05），與宮頸癌患者的年齡、臨床分期和有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 DyrklB在宮頸癌中高表達(dá)，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并有望成為宮頸癌早期診斷的標(biāo)志物和治療的靶基因。

[關(guān)鍵詞] Mirk/Dyrk1B；宮頸癌；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）28-0001-03

Expression and clinical significance of Dyrk1B in cervical carcinoma

LIU Minjie1 FANG Laifu2 HU Pingping1 WENG Kena1 BIAN Jia1 MAO Jiayu1

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China；2.Department of Pathology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of DyrklB in cervical cancer and its clinical significance. Methods Immunohistochemical methods were used to detect the expression levels of DryklB in 60 cases cervical carcinoma tissues，60 cases of cervical cancer adjacent tissues and 60 cases normal cervical tissues. DryklB expression in cervical carcinoma and relationship with clinical parameters of cervical carcinoma. Results The expression of Dyrk1B in cervical cancer tissues was significantly higher than that in cervical cancer adjacent tissues and normal cervical tissues，and there was statistical significance between the three groups（χ2=88.21，P<0.01）. There was a significant correlation between the strong positive rate of Dyrklb and degree of histological differentiation（P<0.05），but there was no correlation between the strong positive rate of Dyrklb and patients age，clinical stage and lymph node metastasis of cervical carcinoma（P>0.05）. Conclusion The expression level of Dyrk1b in cervical carcinoma tissues is high，which indicates that it may participate in the occurrence and development of cervical carcinoma ，and it may become a tumor marker for clinical early diagnosis and a new target gene for treatment of cervical carcinoma.

[Key words] Mirk/Dyrk1B；Cervical carcinoma；Immunohistoehemical

雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B（dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B；又稱Mirk）屬M(fèi)inibrain Dyrk家族成員，是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，該蛋白基因定位在人類19號(hào)染色體q12-13.11上，其功能是特異性磷酸化下游的雙鏈酪氨酸[1]，是一種特異性的雙鏈酪氨酸磷酸化激酶[2]，最初是從結(jié)腸癌細(xì)胞株[3]和人類睪丸組織[4]中分離出來(lái)的。DyrklB可在翻譯過(guò)程中完成自身磷酸化，并同時(shí)有磷酸化其他絲氨酸、蘇氨酸的能力[5]，研究證實(shí)，Dyrk1B在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。通過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)靜止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)通過(guò)siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達(dá)，可減少多種腫瘤細(xì)胞系的集落形成，并增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Dyrk1B 除在人類的腦組織及肌肉組織中有表達(dá)外，在大多數(shù)正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)[6]，但在某些惡性腫瘤組織中呈高水平表達(dá)，如胰腺癌[7，8]、結(jié)腸癌[9]、肺癌[10，11]、卵巢癌[12-14]、橫紋肌肉瘤[15]、前列腺癌[16]等。Dyrk1B在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)宮頸癌組織、癌旁組織及正常宮頸組織中Dyrk1B的表達(dá)情況，探討Dyrk1B與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、分化程度、侵襲的相關(guān)性及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集本院2013年1月～2014年8月宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本60例，年齡25～67歲，平均（51.0±9.2）歲，中位年齡50歲。每例分別取一塊癌組織、癌旁組織和正常宮頸組織進(jìn)行免疫組化染色。宮頸浸潤(rùn)癌60例。宮頸癌按組織學(xué)分級(jí)分為：高分化24例，中分化20例， 低分化16 例； 按2000年FIGO臨床分期分為Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期4例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。所有患者術(shù)前及活檢前均未接受化療或放療。所有標(biāo)本的診斷數(shù)據(jù)均經(jīng)病理證實(shí)， 并附有完整的臨床病理資料。患者術(shù)前均未接受化療或放療。

1.2 試劑與方法

應(yīng)用免疫組化S-P方法檢測(cè)Dyrk1B蛋白的表達(dá)。Dyrk1B抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司，SP試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。Dyrk1B檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟：①石蠟切片3～4 μm，65℃烤片過(guò)夜；②組織切片脫蠟、水化；③滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（3%H2O2，10 min）；④用PBS沖洗3次，每次2 min；⑤抗原熱修復(fù)（EDTA pH=9.0，20 min）；⑥蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑦正常封閉血清（羊血清工作液，室溫下10 min）；⑧傾去血清加一抗室溫1 h（稀釋比Dyrk1B 1∶400）；⑨蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑩二抗，即用型廣譜試劑盒，室溫25 min；{11}蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；{12}DAB顯色3～10 min（即用型DAB顯色液，鏡下控制）；{13}蘇木素復(fù)染、藍(lán)化；{14}切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片.具體操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行。用已知睪丸和骨骼肌作陽(yáng)性對(duì)照，應(yīng)用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，在每個(gè)蠟塊標(biāo)本的連續(xù)切片中選一張做HE染色，用于免疫組化陽(yáng)性染色部位的對(duì)照判定和分析。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

Dyrk1B蛋白主要定位于胞質(zhì)和胞核。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍（×400）視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級(jí)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[14]：（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分率：（a）無(wú)著色，0分；（b）<25%，1分；（c）25%～75%，2分；（d）>75%，3分。（2）顯色深淺：（a）不顯色或顯色不清為0分；（b）淺黃色為1分；（c）棕黃色為2分；（d）棕褐色為3分。以上兩項(xiàng)相加最終評(píng)定結(jié)果，0～1分為陰性（-），2～4分為陽(yáng)性（+），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。校正χ2檢驗(yàn)組間差異的顯著性，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dyrk1B在宮頸癌組織不同部位的表達(dá)情況

Dyrk1B在宮頸癌癌組織（60/60，100%）、癌旁組織（26/40，65%）的表達(dá)水平較正常宮頸組織（16/40， 40%）明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=88.21，P<0.01），見(jiàn)表1。Dyrk1B在正常宮頸組織、癌旁組織及宮頸癌組織中表達(dá)情況見(jiàn)圖1、2、3。

表1 Dyrk1B在宮頸癌組織不同部位的表達(dá)情況

2.2 Dyrk1B表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

表2中可見(jiàn)宮頸癌中Dyrk1B的表達(dá)與年齡、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)關(guān)（P>0.05），與分化程度存在一定的關(guān)系（P<0.05）；Dyrk1B蛋白表達(dá)于所有的宮頸癌組織，但是宮頸癌的陽(yáng)性強(qiáng)度隨宮頸癌組織的病理分化程度的降低而升高，Dyrk1B蛋白在低分化宮頸癌組織的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（16/16，100.0%）明顯高于中分化組（13/20，65.0%）和高分化組（13/24， 54.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.960，P<0.05）。

表2 Dyrk1B蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

宮頸癌在全球女性腫瘤中的發(fā)病率占第3位、死亡率占第4位[17，18]，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率居第一位。研究報(bào)道全球每年新發(fā)宮頸癌例數(shù)約為46.5萬(wàn)，占婦女新發(fā)癌癥病例15%，其中我國(guó)每年新病例有13.15萬(wàn)，約占總數(shù)的1/3。近年來(lái)，年輕婦女的宮頸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其與性生活紊亂、過(guò)早性生活、高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染、吸煙、經(jīng)濟(jì)狀況低下、種族和地理環(huán)境等因素有關(guān)。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)逐步演變、進(jìn)展的復(fù)雜而連續(xù)的過(guò)程，與多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其機(jī)制目前仍不明確。尋找并發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)敏感指標(biāo)，對(duì)阻斷宮頸癌癌前病變的發(fā)展，減少宮頸癌的發(fā)生，對(duì)臨床早期診斷、早期治療、判斷轉(zhuǎn)歸，具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中Dyrk1B蛋白的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)相關(guān)性（P>0.05），但其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)和宮頸癌組織病理分化程度有一定的相關(guān)性，低分化組（16/16， 100%）明顯高于中分化組（13/20，65%）和高分化組（13/24，54.2%），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.960，P<0.05）。Dyrk1B蛋白隨著宮頸癌的病理分化程度降低而升高，提示Dyrk1B蛋白可能參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)宮頸癌的診斷和預(yù)后都有一定的價(jià)值。DyrklB的表達(dá)具有細(xì)胞依賴性，在正常組織細(xì)胞中趨向于細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活與分化，而在腫瘤細(xì)胞中則多富集在細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)，參與腫瘤細(xì)胞抗凋亡活性的產(chǎn)生。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于不利生長(zhǎng)條件下時(shí)，DyrklB可使細(xì)胞進(jìn)入暫時(shí)“休眠”狀態(tài)的G0期，躲避應(yīng)激環(huán)境損傷及化療藥物的“殺傷”，而該過(guò)程是可逆性的，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境改善時(shí)G0期細(xì)胞又可重返細(xì)胞增殖周期，再次開始惡性增殖[19，20]，可見(jiàn)DyrkIB在腫瘤的復(fù)發(fā)與化療耐藥過(guò)程中可能起到了重要作用。

目前，已經(jīng)有研究者將Dyrklb 作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的研究對(duì)象，通過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)靜止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)通過(guò)siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達(dá)，可減少多種腫瘤細(xì)胞系的集落形成，并增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有研究表明通過(guò)siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達(dá)，不僅可大幅度削弱腫瘤軟瓊脂克隆形成和引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加[21]，而且能增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌在體內(nèi)的增殖[22]，聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤患者進(jìn)行治療，最終評(píng)估其作為潛在的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤藥物靶點(diǎn)的可能性。由于Dyrk1B與宮頸癌的診斷和預(yù)后都存在一定的關(guān)系，未來(lái)很可能是一個(gè)潛在的宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物和新的化療藥物靶點(diǎn)基因，為宮頸癌的診斷和治療提供新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Duan Z，Brakora KA，Seiden MV. Inhibition of ABCB1（MDR1） and ABCB4（MDR3） expression by small interfering RNA and reversal of paclitaxel resistance in human ovarian cancer cells[J]. Mol Cancer Ther，2004，3（7）：833-838.

[2] Becker W，Weber Y，Wetel K，et al. Sequence characteristics subcellular localization，and substrate specificity of DYRK-related kinases，a novel family of dual specificity protein kinases[J]. Biol Chem，1998，273（40）：25893-25902.

[3] Lee K，Deng X，F(xiàn)riedman E. Mirk protein kinase is a mitogen-activated protein kinase substrate that mediates survival of colon cancer cells[J]. Cancer Res，2000，60（13）：3631-3637.

[4] Leder S，Weber Y，Altafaj X，et al. Cloning and characterization of Dyrk1B，a novel member of the Dyrk family of protein kinases[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999， 254（2）：474-479.

[5] Becker W，Joost HG. Structural and functional characteristics of Dyrk，a novel subfamily of protein kinase with dual specificity[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1999， （62）：1-17.

[6] Lee K，Den X，F(xiàn)riedman E. Mirk protein kinase is a mitogen-activated protein kinase substrate that mediates survival of colon cancer cells[J]. Cancer Research，2000，60（13）：3631-3637.

[7] Deng X，DZE，S Li AN，et al. The kinase Mirk/Dyrk1B mediates cell survival in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Cancer Res，2006，66（8）：4149-4158.

[8] Deng X，F(xiàn)riedman E. Mirk kinase inhibition blocks the in vivo growth of pancreatic cancer cells[J]. Genes Cancer， 2014，5（9-10）：337-347.

[9] Lee K，Deng X，F(xiàn)riedman E. Mirk protein kinase is a mitogen-activated protein kinase substrate that mediates survival of colon cancer cells[J]. Cancer Res，2000，60（13）：3631-3617.

[10] Deng X，Ewton DZ，Li S，et al. The kinase Mirk/Dyrklb mediates cell survival in non-small cell lung cancer cells[J]. Cancer Research，2006，66（8）：4149-4158.

[11] Gao J，Zheng Z，Rawal B，et al. Mirk/Dyrklb，a novel therapeutic target，mediates cell survival in non-small cell lung cancer cells[J]. Cancer Biol Ther，2009，8（17）：1671-1679.

[12] 楊湘軍，高錦春，胡文峰，等. Dyrk1B在卵巢上皮性癌細(xì)胞中的表達(dá)及在細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47（8）：631-633.

[13] Friedman E. Mirk/dyrk1B kinase in ovarian cancer[J]. Int J Mol Sci，2013，14（3）：5560-5575.

[14] 楊湘軍，高錦春，殷平，等. Mirk/Dyrklb 在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 中國(guó)婦幼保健，2011，26（35）：5614-5616.

[15] Stephen E，Mercer，Daina Z，et al. Mirk/Dyrk1b mediates cell survival in rhabdomyosarcomas[J]. Cancer Res，2006， 66（10）：5143-5150.

[16] Song LN，Silva J，Koller A，et al. The tumor suppressor NKX3.1 is targeted for degradation by Dyrk1B kinase[J].Mol Cancer Res，2015，13（5）：913-922.

[17] Jemal A，BrayF，Center MM，et a1.Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[18] 韓全水，萬(wàn)芬，謝家平. 健康人群液基細(xì)胞學(xué)定期篩查在早期診斷宮頸癌中的意義[J]. 中華健康管理學(xué)雜志， 2010，4（2）：100-102.

[19] Jin K，Ewton DZ，Park S，et al. Mirk regulates the exit of colon cancer cells from quiescence[J]. Biological Chemistry，2009，284（34）：22916-22925.

[20] Hu J，F(xiàn)riedman E. Depleting. Mirk kinase increases cisplatin toxicity in ovarian cancer cells[J]. Genes Cancer，2010，1（8）：803-811.

[21] X Deng DZE，F(xiàn)riedman E. Mirk/Dyrk1B maintains the viability of quiescent pancreatic cancer cells by reducing levels of reactive oxygen species[J]. Cancer Res，2009，69（8）：3317.

[22] Deng X，F(xiàn)riedman E. Mirk kinase inhibition blocks the in vivo growth of pancreatic cancer cells[J]. Genes Cancer，2014，5（9-10）：337-347.

（收稿日期：2015-06-05）