李付鵬等

摘 要 在高等植物中，蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）是蔗糖合成的限速酶。在多種植物中都發(fā)現(xiàn)了SPS基因，而可可中尚未見相關報道。通過分析可可基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定出4個SPS候選基因，依次命名為TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4。4個基因的編碼區(qū)（CDS）長度在3 075～3 228 bp之間，外顯子數(shù)目為12～14，預測蛋白的平均分子量為118.15 ku，等電點均小于7。進化分析結果表明SPS基因家族分成3個亞族；TcSPS1和TcSPS2屬于ClassⅠ亞族，TcSPS3和TcSPS4分別屬于ClassⅡ亞族和ClassⅢ亞族。實時熒光定量PCR分析結果表明，TcSPS1與TcSPS2在樹皮和果實中高量表達，TcSPS3和TcSPS4主要在葉片中表達。伴隨著葉片和花蕾生長發(fā)育，各TcSPS基因表達量均呈現(xiàn)出上升的趨勢，表明其與主要光合產(chǎn)物--蔗糖的合成或再合成有密切聯(lián)系，參與可可“源庫”器官中光合產(chǎn)物分配。

關鍵詞 可可；蔗糖磷酸合成酶；表達分析；系統(tǒng)進化

中圖分類號 S571.3 文獻標識碼 A

Phylogeny and Expression Profile of the Sucrose Phosphate

Synthase Gene Family in Cacao（Theobroma cacao L.）

LI Fupeng1，2，3， QIN Xiaowei1，2，3， WU Baoduo1，2，3， ZHAO Xizhu1，3，

WANG Hua1，3， ZHU Zihui1，3， LAI Jianxiong1，3*

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning，Hainan 571533， China

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Wanning，Hainan 571533， China

3 Tropical Spice and Beverage Germplasm Repository， Ministry of Agriculture，Wanning，Hainan 571533， China

Abstract In higher plants， sucrose phosphate synthase（SPS）is widely considered as a key gene for sucrose synthesis. Although several paralogous genes encoding different isozymes of SPS have been identified and characterized in multiple plant genomes， detailed information about the SPS genes is still lacking for cacao. The study reported that the identification of four novel SPS genes from economically important cacao tree were designated as TcSPS1， TcSPS2， TcSPS3 and TcSPS4. Sequences analyses revealed that CDS of TcSPS1-4 were ranging from 3 075 bp to 3 228 bp， containing 12-14 exons. The average molecular weight of four predicted protein were 118.15 ku， and pIs of all proteins were less than 7. The expression patterns of the cacao SPS genes were investigated via Real-time PCR in various tissues， different developmental phases of leaf， flower bud. TcSPS1 and TcSPS2 were highly expressed in the bark and pods； TcSPS3 and TcSPS4 were predominantly expressed in the leaves. The transcription levels of TcSPS genes were continuously increased along with the leaf and flower bud development. These results indicated that TcSPS genes were significantly related with sucrose synthesis or re-synthesis in source and sink organs， and participate in photoassimilate translocation.

Key words Theobroma cacao L.； Sucrose phosphate synthase； Expression profile； Phylogenetic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.010

蔗糖是植物光合產(chǎn)物和物質轉運的主要物質形式，也是一種重要的信號因子。在植物體內，蔗糖主要由蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖磷酸酯酶（Suc-phosphatase，SPP）進行合成[1]。SPS是調控蔗糖合成的限速酶，催化果糖-6-磷酸和尿苷二磷酸葡萄糖形成蔗糖-6-磷酸，SPP再進一步催化蔗糖-6-磷酸形成蔗糖[2]。

SPS活性與蔗糖積累呈正相關，是光合產(chǎn)物分配的重要因子，在細胞壁合成、果實品質以及種子產(chǎn)量等方面發(fā)揮著重要作用[3-4]。玉米SPS與幼苗生長速度相關；其酶活性在雜交株系中表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，并與干物質積累相關[5-6]。反義抑制馬鈴薯SPS基因，植株塊莖中SPS活性降低，蔗糖合成受到抑制[7]。在馬鈴薯中過量表達SPS基因，葉片中SPS酶活性提高1倍，塊莖中蔗糖含量顯著提高，產(chǎn)量增加20%[8]。自玉米中克隆出首個SPS基因后[9]，相繼從20余種植物克隆了SPS基因[10]。SPS在高等植物中擁有一個基因家族，玉米中存在3個SPS基因位點，SPS基因在擬南芥中擁有4個成員[6，11]。研究結果表明，植物SPS基因家族包含3個亞族：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ；SPS基因家族在進化過程中表現(xiàn)出結構保守，不同成員的功能發(fā)生分化[12]。馬鈴薯的4個SPS基因的表達模式表現(xiàn)出較強的組織差異性，隨著植株發(fā)育表達量有顯著變化[13]。水稻5個SPS基因的表達模式表現(xiàn)出特異性，OsSPS1主要在“源”器官中表達，OsSPS2、OsSPS6和OsSPS8在“源、庫”器官的表達量相當[14]。從現(xiàn)有研究結果可以看出，同一物種不同SPS成員的調控與表達模式不盡相同，各成員在植物體行使的生物學功能也有顯著差別。然而，可可中SPS基因家族的信息卻未見報道。

可可（Theobroma cacao L.，2n=20）是世界三大飲料作物之一，世界上有超過50個國家進行規(guī)模種植?？煽啥沟闹饕?jīng)濟成分是可可脂，主要用于制作巧克力等。蔗糖是種子發(fā)育以及脂肪合成的首要原料，可可豆中蔗糖濃度是脂類物質合成的限制因素[15-16]。因此，蔗糖合成速度及其濃度是影響可可脂合成的關鍵因素。本研究中，從可可全基因組數(shù)據(jù)庫中分析篩選出4個SPS基因，對其進行了基因結構、進化等生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR技術對可可SPS基因家族成員時空表達模式進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實驗所用不同組織的材料，均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所試驗場的可可種質“TAS-R8”；各種組織（葉片、樹皮、花蕾、果實）、不同發(fā)育時期的葉片和花蕾，采自“TAS-R8”成齡植株，樣品采集后立即保存于-80 °C冰箱中備用。

1.1.2 藥品和試劑 RNA提取試劑盒購自Omega公司（R6827-01），反轉錄試劑盒購自Fermentas公司（K1621），實時熒光定量PCR試劑SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自Takara公司（QPK-201），DNase I購自Takara公司，其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器和設備 實驗過程中使用的移液器型號為Eppendorf Research plus，檢測RNA所用電泳槽型號為上海天能HE-120，反轉錄所用PCR儀型號為Agilent SureCycler 8800，實時熒光定量所用PCR儀型號為Bio-rad CFX-96。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA第一條鏈合成 可可總RNA提取利用Omega RNA提取試劑盒，總RNA用DNase I處理之后，用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。RNA提取之后及時進行反轉錄，cDNA第一條鏈用Fermentas反轉錄試劑盒合成，產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍保存于-20 °C冰箱中備用。

1.2.2 可可SPS基因家族成員分離及序列分析 基于可可全基因組序列，利用Blast搜索可可基因組序列中SPS基因家族成員。具體方法如下，利用擬南芥SPS蛋白的保守區(qū)域在可可全基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.cacaogenomedb.org）進行BlastP分析，鑒定可可SPS基因家族成員。利用在線軟件GSDS對可可SPS基因的外顯子/內含子基因結構進行分析[17]。利用EaPASy在線工具（http：//expasy.org/tools/）對可可SPS蛋白分子量、等電點、保守性等進行分析。

1.2.3 序列進化分析 基于擬南芥、楊樹SPS蛋白序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫搜索SPS同源序列，利用MEGA 4.0軟件[18]對來自可可（TcSPS1-4）、獼猴桃（AcSPS2）、擬南芥（AtSPS145.15.2）、白菜（BraSPS4）、復活植物（CpSPS1-2）、黃瓜（CsSPS24）、柑橘（CuSPS1）、大麥（HvSPS1）、番茄（LeSPS1）、蒺藜苜蓿（MtrSPS2-3）、煙草（NtSPS1-2）、水稻（OsSPS128）、楊樹（PtrSPS1-3）、蓖麻（RcSPS14）、甘蔗（SofSPS12）、菠菜（SolSPS1）、小麥（TaSPS12379）、葡萄（VvSPS13）、原生更蘇植物（XhSPS2）、玉米（ZySPS1-2）20種植物42條SPS蛋白序列進行分子系統(tǒng)學分析；具體采用Neighbour-joining方法，測驗進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢測。

1.2.4 定量PCR分析 利用實時熒光定量PCR技術對TcSPS基因家族成員進行時空表達模式分析，以GAPDH作為內參基因[19]。擴增TcSPS1-4基因及內參基因的特異引物用Primer Premier 5.0軟件進行設計，由上海生工生物工程公司合成；引物序列見表1。PCR反應體系為20 μL，包含2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix，10 μmol/L的左右引物各0.8 μL，稀釋50倍的cDNA模板8.4 μL，每個反應組合設置3個重復。PCR反應程序為95 °C預變性3 min；95 °C 變性10 s；57 °C退火15 s；72 °C 延伸30 s；進行39個循環(huán)，每個循環(huán)采集一次熒光數(shù)據(jù)；從65 °C到95 °C，以0.1 °C/s 繪制熔解曲線。反應結束后，利用Bio-rad CFX-96軟件分析擴增曲線和熔解曲線，運用2-△CT方法分析實時熒光定量數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 TcSPS基因家族分離與序列分析

利用BlastP搜索分析可可基因組數(shù)據(jù)庫，篩選出4個SPS候選基因，分別命名為TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4。4個基因編碼的氨基酸長度在1 024～1 075 aa之間，預測蛋白的平均分子量為118.15 ku，等電點均小于7。4個基因氨基酸序列的保守性分析結果表明，TcSPS1與TcSPS2的相似性最高為77.3%，TcSPS1與TcSPS4的相似性最高為55.8%（表2）。

2.2 TcSPS基因結構及系統(tǒng)進化分析

分析比較基因的外顯子/內含子組織結構有助于了解整個基因家族進化。GSDS軟件分析結果表明，TcSPS基因家族成員包含12～14個外顯子（圖1），與植物中其他的SPS基因（如HbSPS1OsSPS1等）結構相似[20-21]，表明植物SPS的外顯子/內含子組織結構在進化中非常保守。除一些外顯子長度的差異外，4個基因間外顯子/內含子組織有較高的保守性，長度為64、132、177、54、63、128 bp均位于4個基因CDS序列中相似的位置。TcSPS1與TcSPS2的外顯子數(shù)目均為13個，外顯子/內含子組織結構也更保守；除以上6個外顯子的長度位置相同外，還共同包含長度為183、90、699、117、274 bp的外顯子。TcSPS基因多數(shù)的內含子長度為70～170 bp之間；TcSPS基因家族成員包含的最長的內含子為999 bp，為TcSPS2的第2個內含子。

為了更好的了解TcSPS基因家族成員與植物其他SPS基因間的進化關系，利用MEGA 4.0軟件構建了包含TcSPS1-4在內42個SPS蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖2）。圖2顯示，42個SPS蛋白可以明顯分為3個類群（ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ），每個亞族均含有雙子葉植物與單子葉植物的SPS成員，表明早在單雙子葉植物分化之前SPS基因就已經(jīng)分化出了3個祖先。相比較ClassⅡ和ClassⅢ的單子葉分支，ClassⅠ的單子葉分支又分出2個亞分支，每個亞分支均包含水稻和小麥的SPS成員，表明ClassⅠ亞族的祖先SPS基因在單子葉進化出來之前就已經(jīng)發(fā)生了分化。對可可而言，3個亞族均包含TcSPS，TcSPS1和TcSPS2屬于ClassⅠ亞族，TcSPS3和TcSPS4分別屬于ClassⅡ亞族和ClassⅢ亞族。在各亞族中TcSPS均與PtrSPS聚在同一分支中， 表明可可與楊樹的SPS基因親緣關系較近，從一定程度上說明可可與楊樹的分化較晚。綜合分析TcSPS基因結構及系統(tǒng)進化樹，外顯子/內含子組織結構與基因的系統(tǒng)進化分析一致，TcSPS基因與物種間的生物進化關系趨于一致。

2.3 TcSPS基因表達模式分析

為了更好了解TcSPS基因的潛在功能，利用Real-time PCR技術分析了TcSPS基因在葉片、樹皮、花蕾和果實中時空表達模式。由圖3可知，TcSPS基因在所檢測的4種組織/器官中均有表達，不同基因的表達模式存在差異但互有重疊。TcSPS1在果實中表達量最高，其次為樹皮，在葉片中的表達量最低，TcSPS1基因在果實與葉片中的表達量相差約8倍。TcSPS2與TcSPS1有相似的表達趨勢，在各組織/器官TcSPS2的表達量均高于TcSPS1；然而TcSPS2在各組織/器官間的表達差異較小，果實與葉片中的表達量相差約2倍。TcSPS3和TcSPS4表達模式類似，在葉片中表達量最高，其次為樹皮，在花蕾中的表達量最低；TcSPS3和TcSPS4基因在葉片與花蕾中表達量分別相差約42和44倍，而在樹皮與花蕾中表達量僅分別相差約5和2倍。

為了更進一步弄清TcSPS基因在“源庫”器官發(fā)育過程中的功能，分析了不同發(fā)育時期葉片和花蕾中各TcSPS基因的表達模式。各TcSPS基因伴隨著葉片生長發(fā)育，基因表達量均呈現(xiàn)出上升的趨勢，成熟葉片中TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4的表達量相比較于嫩葉分別升高了15、6、537、364倍，見圖4。TcSPS1、TcSPS2和TcSPS3基因表達量伴隨著花蕾的發(fā)育呈現(xiàn)上升的趨勢，均在開放的花中達到最大值，比小于2 mm花蕾組織中分別升高了17、3和119倍。TcSPS4基因在可可花開放之前，隨著花蕾發(fā)育表達量略有下降，其在花蕾開放之后，表達量升高約3倍（圖5）。

3 討論與結論

近年來，隨著基因組的快速發(fā)展，越來越多植物全基因組信息被公布出來，這就給通過比較基因組學克隆SPS基因帶來極大便利。本研究借助已經(jīng)測序的Criollo和Amelonado可可種質[22-23]，從可可基因組中鑒定出4個TcSPS基因，平均含有13個外顯子，預測蛋白的分子量在115.60～120.58 ku之間，與植物其他SPS成員非常相似[21]。植物SPS擁有3個亞族，每個亞族的雙子葉植物與單子葉植物的SPS成員均分別聚成一個分支，說明SPS基因在單雙子葉分化前已經(jīng)分化，之后隨著物種的演化而進化[12]。3個亞族均含有TcSPS成員，TcSPS1和TcSPS2屬于ClassⅠ亞族，TcSPS3屬于ClassⅡ亞族，TcSP4屬于ClassⅢ亞族。綜合外顯子/內含子組織結構與系統(tǒng)進化結果，植物SPS基因在進化過程具有較強的保守性。

SPS是蔗糖合成的限速酶，實時熒光定量分析表明TcSPS1-4在所有被檢組織/器官中均有表達，表達模式存在差異但互有重疊，表明各TcSPS基因在植株中行使著不同功能，廣泛參與到可可生長發(fā)育的許多方面。蔗糖主要在“源”器官中合成，僅留少量供“源”器官使用，大部分都被轉運到“庫”器官/組織供其生長或轉化成儲存物質儲藏起來。SPS與“源”器官中蔗糖的合成有密切關系，擬南芥SPS基因的無效突變體，葉片中蔗糖含量維持在偏低水平[24]。玉米“源”葉片中SPS活性與植株營養(yǎng)生長和籽粒產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著正相關關系[25]。水稻的OsSPS1和OsSPS11在“源”器官中有較高的表達量，而OsSPS2、OsSPS6和OsSPS8在“庫”器官中表達量較高[14]。在本研究中，TcSPS1和TcSPS2在“庫”器官（果實）和光合產(chǎn)物運輸通道（樹皮）中有較高的表達量，TcSPS3和TcSPS4在“源”器官（葉片）表達量最高。TcSPS1和TcSPS2可能參與果實中蔗糖的再合成[26]，而TcSPS3和TcSPS4可能調控“源”器官中蔗糖合成與分配，參與到蔗糖在“源”器官的上載過程。盡管各TcSPS基因的表達模式不同，然而4個TcSPS均并伴隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出上升的趨勢，在開放的花中達到最大值，表明TcSPS基因與可可生殖器官的發(fā)育密切相關。

本研究對可可SPS基因家族成員的外顯子/內含子組織結構、系統(tǒng)進化以及表達模式進行了系統(tǒng)的分析，研究結果為進一步分析可可SPS基因家族成員的生理生化功能提供有力參考與借鑒。

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