藺俊麗，李兆才，曹小安，趙 榮，周繼章

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046)

流產(chǎn)嗜性衣原體(Chlamydophila abortus)是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌，是一種重要的人獸共患病病原。動(dòng)物感染流產(chǎn)嗜性衣原體可引起妊娠母畜流產(chǎn)、死產(chǎn)或者產(chǎn)弱胎，公畜發(fā)生睪丸炎、尿道炎等癥狀，孕婦與感染的動(dòng)物直接接觸也會(huì)造成流產(chǎn)及全身感染等癥狀。國(guó)內(nèi)目前對(duì)該病的檢測(cè)方法是間接血凝實(shí)驗(yàn)(IHA)，該法雖然操作簡(jiǎn)單，但有不可避免的主觀性，容易在臨床上造成誤診，為控制和凈化該病帶來困難。對(duì)該病的治療目前一般采用抗生素治療，但容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，引發(fā)持續(xù)、慢性、亞臨床感染。

流產(chǎn)嗜性衣原體巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白(Macrophage infectivity potentiator，MIP)作為一種免疫顯性抗原［1－2］近年來越來越多的被研究。本研究利用前期純化的重組MIP蛋白制備單克隆抗體，以期為進(jìn)一步建立敏感的診斷方法以及流產(chǎn)嗜性衣原體的治療和相關(guān)致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物 流產(chǎn)嗜性衣原體SX5標(biāo)準(zhǔn)株、骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患細(xì)菌病研究室保存，SPF級(jí)Balb/c小鼠(雌性，8周齡)購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640、HAT和HT選擇培養(yǎng)基以及胎牛血清，Gibco公司;細(xì)胞融合劑PEG4000、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)板，Corning公司;單克隆抗體亞類檢測(cè)試劑盒，Protein tech公司;SPF雞胚，北京媯川亞申養(yǎng)殖中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠免疫及MIP多克隆抗體的檢測(cè) 將純化的重組MIP蛋白與弗氏完全佐劑乳化完全后，免疫3只小鼠，腹腔注射和皮下多點(diǎn)注射(50 μg蛋白/只)，二免、三免于第14天、第28天進(jìn)行，用不完全弗氏佐劑乳化。第三次免疫7 d后，小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接血凝法測(cè)定效價(jià)，選擇高效價(jià)者加強(qiáng)免疫3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)，小鼠血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞融合 參照文獻(xiàn)［3］無菌分離免疫鼠脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液，以4∶1數(shù)量與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，室溫1200 r/min離心8 min，使細(xì)胞沉淀，移去上清，往沉淀中緩慢加入1 mL預(yù)熱40℃的 PEG(40%)，時(shí)間控制在60 s左右，HAT培養(yǎng)基定容細(xì)胞懸液體積至50 mL后，轉(zhuǎn)入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，37℃，5%CO2溫箱中靜置培養(yǎng)10 d。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選及雜交瘤細(xì)胞株的建立

用純化的MIP蛋白作為包被抗原，以融合細(xì)胞的上清液為一抗，間接ELISA檢測(cè)篩選分泌抗MIP蛋白抗體的陽(yáng)性克隆。將初步篩選得到的疑似陽(yáng)性細(xì)胞克隆株，用HT培養(yǎng)基有限稀釋后，再進(jìn)行3次亞克隆，用同樣的方法篩選，至陽(yáng)性率達(dá)到100%，將所得的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，建株保存，培養(yǎng)上清即含有大量單克隆抗體。

1.2.4 抗MIP蛋白單克隆抗體的特性鑒定

1.2.4.1 間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià) 以純化的重組MIP蛋白包被酶標(biāo)板(2 μg/孔)，4℃過夜，PBST洗滌四次，5%BSA 37℃封閉1 h，洗滌，將單克隆抗體上清經(jīng)倍比稀釋加入，37℃孵育45 min，洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶10000)，37℃孵育45 min后洗滌，加入顯色劑TMB，避光反應(yīng)10 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，立即于酶標(biāo)儀上讀出每孔450 nm處的吸光值，以產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)為其效價(jià)，同時(shí)以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。

1.2.4.2 單克隆抗體亞類鑒定 操作步驟按照Protein tech公司小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4.3 單克隆抗體腹水制備以及相對(duì)親和力鑒定 按常規(guī)方法［4］取8周齡Balb/c小鼠進(jìn)行腹水制備，并純化腹水單抗。以純化的重組MIP蛋白(2 μg/孔)包板，單抗?jié)舛纫来螢?80、40、20、10、5 μg/mL，每個(gè)梯度三孔，37 ℃孵育 45 min，洗滌后加入酶標(biāo)二抗(1∶10000)，37℃孵育45 min后洗滌，加底物顯色測(cè)定，按50%最大結(jié)合的單抗計(jì)算其相對(duì)親和力。

1.2.4.4 單克隆抗體特異性鑒定 將接種流產(chǎn)嗜性衣原體的雞胚卵黃囊膜研磨，加入SPG緩沖液，5000 r/min離心15 min以除去大塊組織，棄去沉淀，保留上清，14000 r/min離心30 min以沉淀衣原體，棄去上清，保留沉淀，用SPG重懸沉淀后進(jìn)行超聲破碎，超聲功率400 W，超聲5 s間隙5 s，超聲30 min后將流產(chǎn)嗜性衣原體進(jìn)行SDS－PAGE，23 V轉(zhuǎn)膜20 min，5%脫脂奶粉(PBST稀釋)孵育1 h后，以純化的腹水為一抗(1∶1000，2% 脫脂奶粉稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗滌5次，每次3 min，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10000)室溫孵育1 h后PBST洗滌，進(jìn)行顯色曝光。

1.2.4.5 雜交瘤細(xì)胞株染色體核型分析 參照文獻(xiàn)［5］采用秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。選擇

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，加入秋水仙素溶液，終濃度0.4 mmol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，用10 mL離心管1000 r/min離心10 min，棄上清，緩慢加入5 mL 37℃遇熱的KCl(0.75 mol/L)重懸沉淀，置37℃15 min后加入1 mL固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)1 mL，緩慢混勻，1000 r/min 離心10 min，加5 mL固定液重懸沉淀，室溫放置15 min，1000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)一次后重懸，吸取100 μL懸液，于1.5 m高度處垂直低落在－20℃預(yù)冷的載玻片上，自然風(fēng)干后，滴加吉姆薩染色液，20 min后輕柔的洗去染色后，100×油鏡顯微鏡觀察染色體數(shù)目。

1.2.4.6 雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體穩(wěn)定性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［6］將雜交瘤細(xì)胞傳代20次，每次傳代測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià);將雜交瘤細(xì)胞反復(fù)凍存復(fù)蘇，測(cè)抗體效價(jià);將液氮罐中凍存的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，每20 d復(fù)蘇一次，連續(xù)3個(gè)月，測(cè)上清液中的抗體效價(jià)。

1.2.4.7 流產(chǎn)嗜性衣原體中和試驗(yàn) 用SPG緩沖液倍比稀釋 C.abortus(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8)，與相同體積的單克隆抗體混合，接種200個(gè)雞胚，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照組(每株單抗接種100個(gè)雞胚，每個(gè)稀釋梯度以及對(duì)照組20個(gè)雞胚)。培養(yǎng)3 d后每天檢查死亡雞胚數(shù)，直到第9天，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)算雞胚相對(duì)死亡率。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)3次小鼠常規(guī)免疫和一次加強(qiáng)免疫，細(xì)胞融合和3次亞克隆，挑選出疑似陽(yáng)性克隆，以純化MIP蛋白包被酶標(biāo)板，間接ELISA鑒定疑似陽(yáng)性細(xì)胞克隆，共挑選出7個(gè)陽(yáng)性克隆，繼續(xù)傳代培養(yǎng)后得到2個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性克隆連續(xù)亞克隆3次，反復(fù)凍存和復(fù)蘇之后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，確定為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，并命名為 M 1，M 3。

2.2 單克隆抗體效價(jià)及亞類鑒定 ELISA方法測(cè)定兩株單克隆抗體的效價(jià)均為1∶1600(表1);利用單抗亞型鑒定試劑盒對(duì)2株單抗進(jìn)行亞型鑒定，兩株單抗均為IgG1，輕鏈均為κ鏈(圖1)。

表1 間接ELISA對(duì)M1和M3雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

圖1 M1和M3抗體類及亞類鑒定結(jié)果

2.3 單克隆抗體相對(duì)親和力鑒定 ELISA方法測(cè)定單抗相對(duì)親和力，兩株單抗50%最大結(jié)合濃度均為10 μg/mL，50%最大結(jié)合濃度越低，表明親和力越大，所需抗體濃度越低。

2.4 抗體特異性鑒定 在27 kD左右出現(xiàn)明顯的兩條帶，而其他地方?jīng)]有，說明兩株單克隆抗體能特異性識(shí)別重組MIP蛋白，結(jié)果見圖2。

圖2 M1和M3 Western blot特異性鑒定圖

2.5 雜交瘤細(xì)胞系染色體分析 用秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，兩株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目相對(duì)穩(wěn)定，Balb/c小鼠脾細(xì)胞和SP 2/0的染色體數(shù)目分別為20對(duì)和31～34對(duì)，則所獲的雜交瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)該51～54對(duì)之間，結(jié)果見圖3。

圖3 M1和M3雜交瘤細(xì)胞染色體鏡檢圖(吉姆薩染色，100×)

2.6 雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性試驗(yàn)胞體外傳代20次，反復(fù)凍存復(fù)蘇8次，仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且將液氮罐中凍存3個(gè)月的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇，仍能穩(wěn)定分泌抗體。

2.7 流產(chǎn)嗜性衣原體中和試驗(yàn) 2株單克隆抗體經(jīng)倍比稀釋后與同體積經(jīng)SPG稀釋的C.abortus混合，感染雞胚，同時(shí)用培養(yǎng)基做對(duì)照。結(jié)果兩株單克隆抗體均能降低雞胚感染率，雞胚感染率0～10%，而對(duì)照組感染率明顯高，為95% ～100%，說明所制備的MIP單克隆抗體具有良好的中和作用，能有效阻斷感染(圖4)。

圖4 M1和M3對(duì)流產(chǎn)嗜性衣原體的中和試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

MIP最初發(fā)現(xiàn)于嗜肺軍團(tuán)菌中，作為毒力因子［7］在軍團(tuán)菌胞內(nèi)感染早期發(fā)揮重要作用。此后，在銅綠假單胞菌［8］、伯納特立克次氏體［9］、大腸桿菌［10］以及鸚鵡熱衣原體［2］、肺炎衣原體［11］中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Mip樣蛋白和mip樣基因。

MIP是一種“經(jīng)典”的細(xì)菌脂蛋白［12］，在衣原體發(fā)育的兩個(gè)階段均有表達(dá)［13］。MIP在CD14的幫助下激活 TLR2/TLR1/TLR6通路［12］，表明 MIP在衣原體感染中參與了引發(fā)炎癥反應(yīng)的致病機(jī)制。此外，流產(chǎn)嗜性衣原體MIP蛋白相對(duì)于以往衣原體研究的優(yōu)勢(shì)蛋白MOMP、POMP等，與血清有較高的反應(yīng)性［14］，這表明在流產(chǎn)嗜性衣原體感染過程中MIP蛋白扮演了重要角色。

本研究利用前期純化的重組MIP蛋白，運(yùn)用特異、靈敏的間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞株，獲得了兩株單抗。進(jìn)一步利用細(xì)胞核型分析、單抗亞型鑒定、單抗親和力、單抗中和活性鑒定、單抗特異性鑒定對(duì)兩株單抗進(jìn)一步確認(rèn)和評(píng)價(jià)。雖然采用了常規(guī)方法，但獲得了兩株特異性高、穩(wěn)定性好的理想單抗。

對(duì)于單抗中和能力的鑒定，陸春雪等［1］利用制備的單抗與衣原體混合后感染Hela細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察以確定單抗的中和能力。本研究采取類似的方法將單抗與流產(chǎn)嗜性衣原體經(jīng)倍比稀釋，充分混合后接種雞胚，從第3天開始每天查看雞胚死亡情況直到第9天，直接計(jì)算各稀釋度所有天數(shù)中總的雞胚死亡率，以此判定MIP蛋白單克隆抗體的中和能力。本研究接種雞胚的方法雖然傳統(tǒng)，但是操作簡(jiǎn)便，假陽(yáng)性概率低，結(jié)果可靠。通過中和試驗(yàn)驗(yàn)證了抗MIP單抗能顯著降低雞胚感染死亡率，由此可以判定，在流產(chǎn)嗜性衣原體感染雞胚過程中，MIP做為一種毒力因子被其單克隆抗體中和，也從另外一個(gè)方面說明了流產(chǎn)嗜性衣原體MIP在動(dòng)物感染過程中扮演著重要的角色，這為進(jìn)一步研究流產(chǎn)嗜性衣原體感染動(dòng)物的致病機(jī)制提供了新的思路。

此外，兩株單抗50%最大結(jié)合濃度達(dá)到10 μg/mL，抗體親和力較高，結(jié)合半抗原能力較強(qiáng)，這為后續(xù)建立雙抗體夾心ELISA，阻斷ELISA等敏感的、特異的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

總之，制備成功的兩株單克隆抗體不僅對(duì)于建立敏感的動(dòng)物衣原體病診斷方法奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究流產(chǎn)嗜性衣原體的致病機(jī)制提供了新的思路。

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