李文媛,劉艷翠,尹國華,馮克儉,王瑩牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江　157011

Ccbe1病毒對喉癌Hep- 2細(xì)胞VEGF- C表達(dá)的影響

李文媛,劉艷翠,尹國華,馮克儉,王瑩
牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江157011

[摘要]目的探討膠質(zhì)和鈣結(jié)合EGF區(qū)域1（Collagen and calcium binding EGF domains 1,Ccbe1）病毒對人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子-C(vessel endothelium growth factor C,VEGF-C)表達(dá)的影響。方法用1×102，1×104，1×106pfu/mL 的Ccbe1腺病毒作用喉癌Hep-2細(xì)胞，細(xì)胞分為對照組（PBS），Ccbe1病毒高、中、低劑量組。觀察各組細(xì)胞增殖情況，采用PCR檢測各組細(xì)胞VEGF-C mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果與對照組比較，Ccbe1病毒各劑量組細(xì)胞增殖顯著增高，VEGF-C mRNA表達(dá)水平顯著上升，且均有顯著劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論Ccbe1病毒可能通過上調(diào)淋巴管生成因子VEGF-C表達(dá)促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖和淋巴管生成。

[關(guān)鍵詞]Ccbe1病毒；VEGF-C；喉癌；Hep-2細(xì)胞

喉癌是我國東北地區(qū)最為常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤。發(fā)病率高，危害大。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)的發(fā)展，一系列關(guān)于喉癌發(fā)病與治療的相關(guān)機(jī)制得到探討[1]。目前發(fā)現(xiàn)多種淋巴管生成因子參與喉癌的生長與淋巴管轉(zhuǎn)移，有研究表明Ccbe1（膠原和鈣結(jié)合蛋白表皮生長因子-域-1）作為新發(fā)現(xiàn)的一種淋巴管生成因子，在斑馬魚胚胎期進(jìn)行Ccbe1基因沉默后，其淋巴管和血管完全喪失[1]。但關(guān)于Ccbe1對腫瘤細(xì)胞的影響尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)在2014年3月—2014年6月期間通過觀察Ccbe1病毒對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及VEGF-C的表達(dá)的影響，探討Ccbe1對腫瘤細(xì)胞淋巴管生成的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑

實(shí)驗(yàn)時間：2014年3月—2014年6月。胎牛血清（美國Hyclon公司），CCK-8法（美國Sigma公司），PCR試劑盒（Invitrogen公司）；引物設(shè)計（大連寶生物公司）。

1.2細(xì)胞株培養(yǎng)和病毒干預(yù)分組

人喉癌細(xì)胞株Hep-2（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所），依據(jù)參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），至對數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制成單細(xì)胞懸液（4×105/mL）。Ccbe1病毒（Ccbe1 Adenovirus Mouse，購于美國abm公司，No.80829A)，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（PBS），Ccbe1低劑量組（1×102pfu/mL），Ccbe1中劑量組（1×104pfu/mL），Ccbe1高劑量組（1×106pfu/mL）。

1.3 CCK-8法檢測

取各組單細(xì)胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板（每孔100 μL），培養(yǎng)48 h后加入10 μL的CCK-8溶液（sigma公司），常規(guī)CCK-8法檢測，酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測每孔的吸光度值(OD490)。

1.4實(shí)時熒光定量PCR檢測

總RNA提取，采用Pollmann等[4]報道方法進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測及熒光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列為: VEGF-C，上游5′-CTACAGATGTGGGGGTTGCT -3′，下游5′-CATCCAGCTCCTTGTTTGGT -3′；NF-κB，上游5′-GAAGAAGCGAGACCTGGA-3′，下游5′-TCCGGAACACAATGGCCA -3′；βactin，上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′，下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′，分析方法利用2-△△CT方法。

1.5統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料連續(xù)型變量采用（）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Ccbe1對Hep-2細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)1 d后，與對照組相比，Ccbe1各干預(yù)組能夠顯著促進(jìn)Hep-2細(xì)胞生長，中劑量組和高劑量增殖高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，培養(yǎng)3 d和5 d后，Ccbe1各干預(yù)組增殖增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中Ccbe1高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其促進(jìn)作用呈濃度依賴性（見表1）。

表1　CCK-8法檢測Ccbe1對Hep-2細(xì)胞增殖增殖影響[n=6,（±s）]

表1　CCK-8法檢測Ccbe1對Hep-2細(xì)胞增殖增殖影響[n=6,（±s）]

注：*與對照組比較，P＜0.01，#與低劑量組比較，P＜0.05，△與中劑量組比較，P＜0.05。

對照組低劑量組中劑量組高劑量組組別0.025±0.09 （0.046±0.011）*（0.075±0.012）*#（0.082±0.015）*#1 d 0.112±0.015 （0.235±0.024）*（0.299±0.019）*#（0.367±0.023）*#△0.321±0.025 （0.535±0.034）*（0.639±0.036）*#（0.727±0.023）*#△3 d　5 d

2.2各組細(xì)胞VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平比較

與對照組比較，Ccbe1病毒低、中、高劑量組VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中Ccbe1病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平顯著高于Ccbe1病毒低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，見表2。

3　討論

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，在我國東北地區(qū)發(fā)病率逐年上升，其中近95%患者為鱗狀上皮癌，其細(xì)胞系為hep-2細(xì)胞，盡管近年來相關(guān)治療如激光切除術(shù)和化學(xué)藥物治療已取得了較大進(jìn)展，但淋巴管轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20%，因此，開發(fā)新的有效治療喉癌淋巴管轉(zhuǎn)移的方法已尤為迫切。

表2　各組細(xì)胞VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平比較[n=6,（±s）]

表2　各組細(xì)胞VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平比較[n=6,（±s）]

注：*與對照組比較，P＜0.01，#與低劑量組比較，P＜0.05，△與中劑量組比較，P＜0.05。

對照組低劑量組中劑量組高劑量組組別0.0015±0.0006 （0.0026±0.0004）*（0.0038±0.0005）*#（0.0052±0.0006）*#△VEGF-C mRNA

以往研究已經(jīng)證實(shí)喉癌中VEGF-C表達(dá)上調(diào)，但對于VEGF-C在喉癌細(xì)胞系方面的研究仍存在爭議[3]。VEGF-C能夠選擇性增強(qiáng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂；刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生并促進(jìn)淋巴管生成；參與淋巴管外基質(zhì)重塑。到目前為止已有大量的研究證明在胚胎發(fā)育、組織再生和腫瘤的生長過程VEGF-C在淋巴管新生過程中有極其重要的作用[1]。最近發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白Ccbe1是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究發(fā)現(xiàn)[2]在斑馬魚、小鼠和人類，Ccbe1基因突變導(dǎo)致淋巴管增生和淋巴水腫（Hennekam綜合征），Ccbe1促進(jìn)淋巴管新生并且可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，發(fā)現(xiàn)胚胎期在一些組織Ccbe1和其他的淋巴管生成因子表達(dá)下降，并證實(shí)Ccbe1能夠獨(dú)立調(diào)節(jié)淋巴管生成。但Le等[5]發(fā)現(xiàn)Ccbe1在卵巢癌細(xì)胞株中顯著下調(diào)，與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。前期研究[6-7]證實(shí)喉癌中Ccbe1表達(dá)顯著增高，參與喉癌淋巴管生成和血管生成，該研究從體外實(shí)驗(yàn)探討Ccbe1的作用機(jī)制。

Jeltsch[2]表明Ccbe1是VEGF-C活化的必要條件，VEGF-C信號通路可能是Ccbe1作用的重要下游信號通路。該研究CCK-8法結(jié)果表明，Ccbe1各干預(yù)組能夠顯著促進(jìn)Hep-2細(xì)胞生長，其中3 d和5 d，Ccbe1高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，顯示Ccbe1干預(yù)組能夠顯著促進(jìn)喉癌hep-2細(xì)胞增殖，并具有濃度依賴性，證實(shí)了Ccbe1能夠促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖能力，這與Pollmann等的研究結(jié)果相一致[4，8]。但Ccbe1的作用機(jī)制目前尚不明確，該研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較，Ccbe1病毒各劑量組VEGF-C mRNA表達(dá)水平均顯著上升，其中Ccbe1病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達(dá)水平顯著高于Ccbe1病毒低、中劑量組，高于對照組4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我們推測Cebe1可能通過上調(diào)VEGF-C信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，該研究證實(shí)了Ccbe1能夠上調(diào)喉癌hep-2細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)，提示Ccbe1可能通過活化VEGF-C，促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖和淋巴管轉(zhuǎn)移。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Du L, Li H, Zhu C, et al.Incidence and mortality of laryngeal cancer in China, 2011[J]. Chin J Cancer Res, 2015(1):52-58.

[2]Jeltsch M, Jha SK, Tvorogov D,et al. CCBE1 enhances lymphangiogenesis via A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-3-mediated vascular endothelial growth factor-C activation[J].Circulation, 2014,129(19):1962-1971.

[3]Xu Y, Yuan L, Mak J,et al. Neuropilin-2 mediates VEGF-C-induced lymphatic sprouting together with VEGFR3[J]. J Cell Biol，2010，188(1): 115-130.

[4]Pollmann C, Hogerling R, Kiefer F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function[J].Adv Anat Embryol Cell Biol, 2014,214(3):167-86.

[5]Barton CA,Gloss BS,Qu W,et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival[J].Br J Cancer,2010,102(1):87-96.

[6]李文媛,王瑩,劉艷翠,等.膠原和鈣結(jié)合EGF域1的表達(dá)與直腸癌組織淋巴管生成及預(yù)后的關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34(14): 3849-3851.

[7]李文媛,王瑩,孫平,等.喉癌組織中Ccbe1、VEGF-D的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥, 2013,53（23）:21-24.

[8]Zou Z, Enis DR, Bui H, et al.The secreted lymphangiogenic factor CCBE1 is essential for fetal liver erythropoiesis[J].Blood, 2013 ,121(16): 3228-36.

Impact on VEGF-C Expression of Ccbe1 Virus to Laryngeal Cancer Hep-2 Cells

LI Wen-yuan,LIU Cui-yan,YIN Guo-hua,FENG Ke-jian,WANG Ying
Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang, Heilongjiang Province, 157011 China

[Abstract]Objective To investigate the impact on Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) expression of Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus to laryngeal cancer Hep-2 Cells. Methods Cells were divided into control group (PBS), Ccbe1 virus in high, medium and low dose group, by the way of Ccbe1 adenovirus (in respective units 1× 102, 1×104, 1×106pfu/mL) acting on laryngeal cancer Hep-2 Cells. The cell proliferation was observed and the expression level of VEGF-C mRNA was detected by PCR for each group. Results Compared with the control group, the cell proliferation of Ccbe1 virus was significantly higher in each group, and the VEGF-C mRNA expression level was significantly increased than that in control group (P<0.05), and there were significant dose-dependence. Conclusion Ccbe1 virus may upgrade Lymph vessel generation factor VEGF-C expression to promote hep-2 cells proliferation and lymphatic formation in laryngeal cancer.

[Key words]Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus; Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C); Laryngeal cancer; Hep-2 cell

[中圖分類號]R739.65

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0010-03

[基金項(xiàng)目]黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目（12531745）

[作者簡介]李文媛（1980-），女，黑龍江伊春人，碩士，講師，主要從事腫瘤淋巴管生成機(jī)制研究。

[通訊作者]王瑩( 1977-)，男，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，研究方向:腫瘤發(fā)生機(jī)制。

收稿日期：（2015-04-25）