孫旭，羅余萍

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心、藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床藥理研究所，江西 南昌 330006

Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人結(jié)腸癌細(xì)胞，是一種研究口服藥物吸收特性的細(xì)胞模型，結(jié)構(gòu)與生化特點(diǎn)類似于人類小腸上皮細(xì)胞[1]。細(xì)胞在生長(zhǎng)到一定程度后能形成微絨毛，并能分泌出小腸刷狀緣上皮特異的堿性磷酸酶[2-4]。Caco-2細(xì)胞在體外的培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)、藥物腸吸收機(jī)制的研究等[5]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Caco-2細(xì)胞單層模型的評(píng)估方法有很多，比如跨膜電阻(Teer值)的大小，甘露醇或熒光黃透過(guò)性試驗(yàn)及堿性磷酸酶活性等[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Caco-2細(xì)胞在Transwell板中跨膜電阻的檢測(cè)及Transwell小室內(nèi)外堿性磷酸酶活性的檢測(cè)，對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型的建立進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源 購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心( American Type Cμlture Collection，ATCC)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均在30～40代范圍內(nèi)。

1.2 主要試劑 DMEM高糖含雙抗培養(yǎng)基：北京索萊寶公司；二甲基亞砜(Dimethyl sμlfoxide，DMSO)：美國(guó)Amresco公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：全式金公司；PBS Buffer緩沖液：江西南昌長(zhǎng)城生物科技有限公司；0.25%胰酶-EDTA：Sigma公司；堿性磷酸酶試劑盒：南京建成生物有限公司。

1.3 主要儀器 Milli-Q Gradient A10 超純水器：美國(guó)Millpore公司；CKX-41型倒置光學(xué)顯微鏡：日本Olympus；EVOM細(xì)胞電位儀：美國(guó)WPI；YXQ.SG41.280.B高壓滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus Heracell 150)：德國(guó)賀利氏；T-25培養(yǎng)瓶、24孔Transwell培養(yǎng)板(膜面積為0.33)：美國(guó)Corning公司；超凈臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：玉環(huán)縣五金光學(xué)儀器廠；低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法及結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 所用培養(yǎng)基為DMEM高糖含雙抗培養(yǎng)基(1%非必須氨基酸、1%L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10%胎牛血清)，接種于T-25培養(yǎng)曲頸瓶中，環(huán)境條件：培養(yǎng)箱37℃， 5%CO2，相對(duì)濕度90%。接種后24～48h內(nèi)更換培養(yǎng)液，洗去死細(xì)胞殘?jiān)?。之?天換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合約達(dá)80%左右，用37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA消化液進(jìn)行消化，以1:3進(jìn)行傳代。

2.2 細(xì)胞復(fù)蘇 將一支標(biāo)記為2009年Caco-2細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速放入已升為恒溫37℃的水浴鍋中，并不斷晃動(dòng)(盡量不要讓水浴鍋中的水碰到凍存管管蓋)，使管里的細(xì)胞盡快溶解，溶解后拿于細(xì)胞房。將細(xì)胞用移液管移到已有5ml含10%胎牛血清培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，倒棄上清，往沉淀中加入2ml新鮮培養(yǎng)基，混勻后移到25cm2的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基到5ml，混勻。放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 Caco-2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(Teer)的檢測(cè)

2.3.1 制備單個(gè)細(xì)胞懸液 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗2次后加入1.2ml胰蛋白酶消化3～5min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打管吹打使細(xì)胞完全脫壁，移至15ml離心管中，1000rpm離心5min，倒棄上清，加入5ml新鮮完全培養(yǎng)基，混勻。

2.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 100μl單個(gè)細(xì)胞懸液+900μl培養(yǎng)基，混勻，滴入計(jì)數(shù)板上蓋玻片的邊緣，由于虹吸作用，液滴可均勻進(jìn)入蓋玻片底下的網(wǎng)格。

由此：離心管中的細(xì)胞密度為6×105/ml。

2.3.3 細(xì)胞接種Transwell板 將上述細(xì)胞密度調(diào)整到6×104/ml后接種于Transwell24孔板中，Transwell濾膜的頂側(cè)(apical side，AP)加入細(xì)胞懸液100μl，基地側(cè)(basolateral side，BL)加入無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基600μl。

2.3.4 Transwell板跨膜電阻(Teer)檢測(cè) 電極處理：70%乙醇溶液浸泡15min，空氣干燥15s，放入無(wú)菌PBS溶液中浸泡過(guò)夜。

Teer值是反映細(xì)胞單層完整性的一個(gè)指標(biāo)，一般Teer值在200Ω·cm2～1000Ω·cm2范圍之內(nèi)，值越大便認(rèn)為細(xì)胞單層致密完整。培養(yǎng)在Transwell板中的細(xì)胞，隔天換液，一個(gè)星期后每天換液。選取種板后的第2、5、7、10、15、20、22、25天分別檢測(cè)電阻值。首先吸棄培養(yǎng)液，小室內(nèi)外均加入預(yù)熱的PBS溶液，重復(fù)三次，其中第三次放于培養(yǎng)箱中孵育30min后連上細(xì)胞電位儀測(cè)電阻。

跨膜電阻(Teer)值=(樣品孔電阻-空白孔電阻)×膜面積

24孔板的膜面積為0.33cm2。結(jié)果分析：經(jīng)測(cè)定，corning公司的Transwell 24孔板的空白電阻為100Ω左右，此次細(xì)胞培養(yǎng)前10天，細(xì)胞增殖緩慢，直到種板后的第10天，Teer值仍然在54Ω·cm2，與文獻(xiàn)報(bào)道不是很一致，可能原因是細(xì)胞接種密度比文獻(xiàn)低，至20天時(shí)Teer值達(dá)到500Ω·cm2，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞已形成了完整的致密單層，之后，Teer值增到627Ω·cm2后保持不變(見(jiàn)圖1，表1)。

2.4 Caco-2細(xì)胞極性考察 堿性磷酸酯酶是小腸上皮刷狀緣標(biāo)志性酶，在Caco-2細(xì)胞單層形成過(guò)程中可以分化出此酶。通過(guò)測(cè)定Caco-2細(xì)胞單層各階段的堿性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase)活性可反映Caco-2細(xì)胞的生化特性以及細(xì)胞極性。本實(shí)驗(yàn)使用AKP試劑盒按說(shuō)明書步驟分別在Caco-2細(xì)胞接種第3、15、22天從Transwell膜的兩側(cè)取樣，測(cè)定不同時(shí)間段的堿性磷酸酶活力。

AKP試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

堿性磷酸酶活性(U/100ml)=樣品酚濃度×100ml/0.05ml

結(jié)果分析：本實(shí)驗(yàn)接種到Transwell 24 孔板第3天的磷酸酶活性非常低，AP/BL為1.19。到了第15天小室內(nèi)的磷酸酶活性明顯比小室外高，AP/BL達(dá)到3.62。而接種后的第22天，磷酸酶活性進(jìn)一步升高，AP/BL達(dá)到5.42。與第三天相比，第22天的磷酸酶活性增高了5倍多，為第15天時(shí)的2倍。由此可見(jiàn)，堿性磷酸酶的分布非常不對(duì)稱，出現(xiàn)了明顯的極化現(xiàn)象(見(jiàn)表2)。

圖1 Caco-2細(xì)胞單層模型跨膜電阻值Fig-1 Transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers

圖2 AKP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig-2 Standard curve of AKP

3 討論

藥物代謝特性研究是藥物研發(fā)成功與否的重要因素之一。以往傳統(tǒng)的體內(nèi)藥代吸收篩選模型，由于所需藥物量大、難以批量化、耗時(shí)長(zhǎng)以及費(fèi)用高等弊端，已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)代新藥的研發(fā)要求，快速、準(zhǔn)確以及需藥量少的藥物吸收篩選模型已成為新藥研發(fā)的重要方法。目前，被廣泛采用的三種篩選方法是：大鼠原位單次灌注法、大鼠外翻腸囊法以及體外人結(jié)腸腺癌(Caco-2)細(xì)胞系法。其中，Caco-2細(xì)胞模型已經(jīng)成為一種預(yù)測(cè)藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)體外篩選工具。從80年代起，Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)模型就廣泛用于模擬小腸環(huán)境進(jìn)行口服藥物吸收情況的體外篩選，以及口服藥物吸收機(jī)制的研究[7]。對(duì)于Caco-2細(xì)胞單層模型完整性的評(píng)估，國(guó)內(nèi)外均有大量報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中方法，所用細(xì)胞代數(shù)為30-40代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖迅速?？捎糜诩?xì)胞單層模型的建立。

表1 Caco-2細(xì)胞單層模型電阻和跨膜電阻值Tab-1 Resistance and transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers

跨膜電阻(Teer值)是檢測(cè)Caco-2細(xì)胞單層模型完整性的指標(biāo)之一，單層模型越完整，所形成的跨膜電阻越大。一般認(rèn)為，＞200Ω·cm2時(shí)，細(xì)胞單層模型就已形成，Teer值繼續(xù)增大，單層模型越致密[8]。本次實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞接種到Transwell板后的第7天，跨膜電阻就已達(dá)到209.75Ω·cm2，第10天后，幾乎成線性上升，直到第22天到達(dá)一個(gè)穩(wěn)定值627Ω·cm2。細(xì)胞形成了非常致密的單層。

堿性磷酸酶是小腸上皮刷狀緣細(xì)胞的標(biāo)志性酶，在細(xì)胞接種到Transwell板中后，可通過(guò)不同時(shí)間分別檢測(cè)Transwell板頂側(cè)(AP)和基底側(cè)(BL)的堿性磷酸酶活性，對(duì)細(xì)胞分泌的磷酸酶進(jìn)行定位。試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞生長(zhǎng)的第3天，磷酸酶活性非常低，第15天時(shí)磷酸酶活性比較高。到了第22天時(shí)，磷酸酶活性進(jìn)一步增加，AP/BL為第15天時(shí)的2倍。說(shuō)明細(xì)胞可以產(chǎn)生極化。

表2 堿性磷酸酶活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系(n=4, Mean±SD)Tab-2 The relationship between alkaline phosphatase activity and the length of time in culture(n=4, Mean±SD)

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